细菌cGAS/DncV样核苷酸转移酶下游效应蛋白——Cap4

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cGAS/DncV样核苷酸转移酶（cGAS/DncV-like nucleotidyltransferases，CD-NTases）是一类合成核酸第二信使的免疫感知酶类，能够激活级联系统并调控下游反应，以启动细菌以及动物细胞中的初始抗病毒反应。CD-NTase在动物和细菌信号传导系统中均相当保守，在先天免疫和噬菌体防御过程中发挥了至关重要的作用【1】（详见：Nature深度|细菌中也有cGAS？哈佛科学家发现发现一大类cGAS/DncV样核苷酸转移酶）。人类CD-NTases环鸟苷酸（GMP）-AMP合成酶（cGAS）在病原体复制和癌症发生过程中能够感知细胞内异常定位的双链DNA，产生核苷酸第二信使2’-5’,3’-5’ cyclic GMP-AMP (2’3’-cGAMP)，诱导抗病毒免疫和干扰素信号发生【2】。细菌中含有5600多个特异性CD-NTases酶，它们可以控制多种统称为CBASS（cyclic oligonucleotide-based antiphage signaling system)的抗病毒免疫系统【3】。细菌CD-NTases通过合成环二核苷酸和环三核苷酸产物，利用所有四种核糖核苷酸构成其信号的特异性，并增加CBASS抗病毒免疫反应的多样性【4】。在人类细胞中，cGAS产物2’3’-cGAMP中的非典型2’-5’连接键对于免疫特异性和下游受体STING（stimulator of interferon genes）的激活至关重要【5】。然而，在细菌CBASS抗病毒免疫中，受体的激活是否依赖于磷酸二酯键特异性仍然未知。至今为止，研究较为透彻的细菌CD-NTases核苷酸第二信使受体为patatin样磷脂酶，在核苷酸信号结合时被激活从而降解膜磷脂。如霍乱弧菌Vibrio cholerae中CapV（cGAMP-activated phospholipase in Vibrio）能够响应3’3’-cGAMP并引起细胞膜破裂和细菌细胞死亡【6】。CBASS操纵子对单核苷酸第二信使具有较高特异性，然而迄今在CBASS操纵子编码的细菌CD-NTase酶中尚未发现CapV样受体，表明下游效应蛋白仍有待发掘。近日，来自哈佛医学院的Philip J. Kranzusch团队在Cell杂志上发表了题为CBASS Immunity Uses CARF-Related Effectors to Sense 3’–5’- and 2’–5’-Linked Cyclic Oligonucleotide Signals and Protect Bacteria from Phage Infection的研究论文。该研究主要以阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae, E. cloacae）为研究对象，从一个含有2000多个成员的能够响应CD-NTases的细菌受体家族中，发现了一个重要的核苷酸第二信使受体家族蛋白，即CD-NTase相关蛋白4（CD-NTase-associated protein 4，Cap4）。研究证明Cap4能够通过SAVED结构域敏锐地辨别细菌中的2’-5’和3’-5’环寡核苷酸信号，进而识别核苷酸第二信使簇，在细菌抵御噬菌体感染过程中发挥了重要作用。E. cloacae CD-NTase CdnD (CD-NTase in clade D，EcCdnD)在体外具有组成型活性，可以合成环三核苷酸第二信使3’3’3’ cyclic AMP-AMP-GMP（3’3’3’-cAAG）【1】。EcCdnD操纵子包括三个未知功能的基因，编码了CD-NTase相关蛋白2、3和4（CD-NTase-associated protein，Cap2、Cap 3和Cap 4）。首先，作者通过凝胶迁移实验（EMSA）发现EcCap4是特异性识别EcCdnD核苷酸第二信使的下游受体，且Cap4蛋白能够利用类II型限制酶反应来降解DNA，是依赖于核苷酸第二信使门控酶激活调控的dsDNA内切酶。而后，作者进一步研究了CD-NTase-Cap4信号的特异性，发现CD-NTase合成的非典型2’-5’磷酸二酯键RNAs也参与了细菌的抗病毒信号传导，而Cap4核酸酶作为选择性传感器，可以利用连接键的特异性来适应不同的CD-NTase核苷酸第二信使信号。进一步对CD-NTase-Cap4复合体的结构进行探究，作者发现SAVED结构域是参与III型CRISPR免疫的两个CARF（CRISPR-associated Rossman fold）结构域的融合形式，并且Cap4中SAVED结构域的单链结构能够辨别不同的非对称性核苷酸识别信号。随后，作者研究了Cap4依赖配体激活的机制，发现Cap4的激活遵循了一个“两步模型”，即SAVED结构域识别核苷酸第二信使后Cap4发生寡聚化，而后Cap4与底物DNA结合并使DNA靶向降解。Cap4调控模型中，配体诱导的寡聚化激活了Cap4的内切酶结构域，并致使基因组或质粒DNA被随机切割成仅6 bp左右的小片段。从已知序列的CD-NTase操纵子中，作者发现有29.8%的蛋白含有SAVED结构域，其中就包括CBASS抗噬菌体免疫的效应分子。因此，核苷酸第二信使诱导的SAVED寡聚化是激活不同效应分子功能的普遍策略，用以限制噬菌体复制从而保护细菌抵抗噬菌体感染。最后，作者检测了CD-NTase信号通路的特异性，发现含有SAVED结构域的蛋白能够专一地识别特定的核苷酸第二信使，这种核苷酸配体的特异性使得CBASS免疫具有独立于其他宿主信号的特性。总之，本文发现Cap4是细菌响应CD-NTase信号的关键成员，Cap4中 DNA内切酶/ DUF4297结构域的激活是通过配体介导的寡聚化进行的，而寡聚核苷酸识别则发生于由两个CARF亚基融合形成的SAVED结构域。SAVED效应物能够精确地辨别3’-5’和2’-5’环寡核苷酸信号，并能特异性识别至少180种潜在的核苷酸第二信使簇，表明SAVED/CARF家族蛋白是CBASS和CRISPR免疫抵抗中的重要核苷酸第二信使受体。