非损伤性基因取样

非损伤性基因取样(noninvasive genetic sampling ，NGS)，是在不捕获、触及，甚至在未亲眼见到动物的情况下，收集不同形式的样品获取样品中的DNA。样品包括毛发、粪便、尿液、脱落羽毛、含口腔脱落细胞的食物残渣、鳞片以及卵壳等。由于非损伤性取样的广泛性、随机性和便利性，使其在物种鉴别、个体识别、性别鉴定、种群亲缘关系鉴定、种群数量估计等方面得到了广泛的应用。1

取样方法粪便

粪便中含有肠道脱落细胞，人们可以从粪便中提取DNA 进行遗传分析。粪便的非损伤性取样是最具有潜在价值的。它是所有非损伤性取样中最简单而且对野生动物影响最小的一种取样方法。但此法主要存在两个问题。第一，粪便中的DNA 存在一定程度的降解。尽管新鲜粪便中含大量肠道脱落细胞，可大大提高遗传分析的成功率和可行性，但是在实际的野外研究中，获取新鲜粪便是十分困难的。通常获取的粪便样品中DNA 存在严重降解。要减缓粪便中目标DNA 的降解，需要有效的保存方法。另一个问题，粪便中含有大量抑制Taq 酶活性的物质，对PCR 扩增效果有一定影响。

利用粪便非损伤性取样获取的DNA 进行研究的报道有很多。杨水云等通过制备小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica) 的阳性模板，配制模拟带菌粪便，结合粪便非损伤性取样建立了一套从大熊猫粪便检测肠道病原菌的基因诊断技术。这种快速鉴别诊断病原菌的技术为患病人畜争取了治疗时间，特别是对大熊猫这样的珍稀物种意义重大。

毛囊

毛发的非损伤性取样已在分子生态学中得到了广泛的应用。研究中通过搜集动物脱落或被树枝刮落的毛发来进行毛发的非损伤性取样。毛发中的DNA 主要集中在毛囊细胞中。在从动物体上采集或脱落的毛发中，绝大多数都带有完整的毛囊。从毛囊中提取DNA，通常采用直接经蛋白酶K 消化后，再用酚-氯仿多次抽提的方法或蛋白酶K 消化与Chelex-100 相结合的方法。

在毛发中除了毛囊外，还有微量DNA 存在于毛干的髓质中。然而，从毛干髓质获取微量的DNA 要求严格的操作，而且提取DNA 所用的毛干部位距毛根越远越不容易得到，因此这种方法在实际应用中受到了限制，仅用于没有毛囊或毛囊已败坏而毛发样品又很难得到的情况。

馆藏标本

馆藏标本包括了动物干皮标本、浸泡于福尔马林液中的标本组织以及骨骼。从保护遗传学的角度考虑，首先，馆藏标本取样方便而且相对于粪便和毛囊的非损伤性取样选材范围较广；其次，可利用不同年限的馆藏标本对动物的遗传变异及遗传多样性进行研究分析，这样就为制定相关的保护措施提供了可能。鬣羚(Capricornis sumatraensis)作为国家二级保护动物，近年来，种群数量已经急骤下降，为了澄清这种动物在系统进化和分类上的混乱局面以更好的保护其种群多样性，崔雨新等对5 份不同种群鬣羚干皮标本进行DNA 提取，利用mtDNA 细胞色素b 的通用引物成功地扩增出cy t b 的约500 bp 的片段，证明了通过干皮标本研究动物遗传分化的可行性。从馆藏标本中提取DNA 不仅受到标本性质、保存方式、DNA 样品性质等因素的影响，还受到提取方法的影响。

口腔脱落细胞

利用口腔脱落细胞作为获得DNA 的来源的可靠性一直受到关注，而且口腔洗液中的食物残渣又是否会对DNA 的检测分析产生影响也是一个值得讨论的问题。程家蓉等对用人口腔细胞作为来源提取DNA 做基因多态性分析的可行性做了实验和分析。除其中一例外，所有口腔细胞样品均能扩增出目的基因片段，并且所有的食物DNA 全部未被扩增，口腔洗液与相应血液的基因多态性结果一致。因此可以证明口腔脱落细胞用于非损伤性取样分析是可行可靠的。

脱落羽毛、鳞片、尿液等

除了上文提及的几种取样方法外，研究者们还从其他方面入手，对不同形式的动物样品进行非损伤性取样。田秀华等对大鸨羽毛的不同部位的DNA 提取进行研究，发现羽髓、羽鞘和羽根可以提出一定纯度的核DNA 和mtDNA，实心羽茎可以提出一定纯度m t-DNA。还有报道称，从蛋壳膜中提取DNA 是一种较好的方法，特别是当蛋壳膜上有血管时。随着非损伤性取样的研究不断深入，其样品形式将不仅包括毛发、粪便、尿液、脱落羽毛、含口腔脱落细胞的食物残渣、鳞片以及卵壳等，还会有更多更广泛的研究样品。1

存在的问题目前，利用粪便，毛发等非损伤性取样进行研究已得到广泛应用，然而非损伤性取样的局限性是不容忽视的。利用非损伤性取样获取的DNA 含量低，质量不高，并存在着一定程度的降解，而且样品中常含有影响Taq 酶活性的抑制剂。另外，在DNA 提取过程中或PCR 扩增过程中容易受到外源遗传物质的污染。所以，能用于基因型分析的DNA 含量是很低的，通常在10-12的数量级。在这种条件下，进行PCR 扩增得到的产物，可能存在两个问题:(1) 基因丢失(allelic dropout) (2) 假等位基因(false allele)。面对非损伤性取样存在的各种问题，人们通过改进样品保存方法及DNA 提取方法等一系列途径来解决。Roon等利用二氧化硅颗粒干燥及-20 ℃条件对棕熊(Ursus arctos) 毛发处理保存，毛发DNA 降解明显减缓。Tomoko等利用蛋白酶K 和胶原酶相结合的方法从脱落羽毛和蛇蜕中提取DNA 。实验证明这种方法比传统的提取DNA 的方法产量高出约100 倍，而且被提取出的DNA 能用于PCR扩增和其它分析。当样品中DNA 含量很少且未知的时候，在各种解决方法中，多管法(multiple tubes approach) 是获取可靠遗传分析结果的最好途径之一。这种方法原理是:对每一个选定的遗传标记位点独立地进行多次PCR 扩增以提高可信度。理论上进行7 次独立的操作可信度即可达99 %，实际操作中次数一般大于7 次。但是，多管法耗时且价格昂贵。1

研究展望当前，从提取样品中DNA 含量和质量以及利用样品进行后续分析得出结果的可靠性上看，采用非损伤性取样还不能达到破坏性取样或非破坏性取样同样的效果。然而，非损伤性取样的应用前景是广阔的。首先，非损伤性取样在保护遗传学、行为生态学、分子粪便学、系统地理学等领域的应用与发展为野生濒危物种的保护及研究提供了有效的辅助支持。其次，从生物统计学的角度而言，尽可能随机获取更多的有效样本是至关重要的，非损伤性取样恰恰弥补了传统取样法在这方面的不足。最后，目前已有一些辅助的方法，如:建立数学模型，采用计算机模拟实验或利用可行性评估实验研究模型来辅助分析，使非损伤性取样的遗传分析结果更加可靠。随着非损伤性取样的现实意义不断凸显，该方法将会得到更深入和广泛的应用。1

本词条内容贡献者为:

赵阳国 - 副教授 - 中国海洋大学