【Protocol】qRT-PCR相对定量分析—2-ΔΔCt法

概念：RT-PCR和qRT-PCR

RT-PCR就是逆转录或称反转录PCR（reverse transcription PCR），是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形，基本概念就是一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

qRT-PCR（Quantitative Real-time PCR）是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，由此可以对起始模板数量或最终复制数量进行精确分析。

那么qRT-PCR是如何实现定量的呢？在PCR的反应中，引入一种荧光化学物质。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号也会等比例增加。每经过一个循环，收集到一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度的变化检测产物量的变化。

那么如何进行相对定量呢？

直接上干货：

Livak法（建议还是直接去看这篇文献，会更好的了解2-ΔΔCt法）

（Livak and Schmittgen, Methods, 2001）

数据示例计算：

一个对照组Control，一个处理组Treatment，一个内参基因Actin，一个目的基因Target。

1.计算每组内参基因Actin的CT均值。

2.计算ΔCT值，即每组目的基因Target减去对应内参基因Actin的CT均值。

3.计算对照组Control中的ΔCT值，再用处理组的每一个ΔCT值减去刚刚计算得到的对照组Control中的ΔCT值，得到ΔΔCT。

4.相对表达量2-ΔΔCT即可得出。

另外如果你只是想很快的看下相对表达量的柱形图结果，可用TBtools里的qPCR Result Summary功能（Chen et al., Molecular Plant, 2020）。

来源：植物生物学