数字PCR如何实现无内参基因的尿液外泌体miRNA定量检测

来源：分子生物应用题目：与qPCR相比数字PCR更好地检测尿液中外泌体miRNA 

目的：对尿中miRNAs的定量分析具有很大挑战性，尤其是对于低丰度miRNAs定量。本文的目的是实现尿液中外体miRNAs的定量，并比较数字PCR（dPCR）和实时定量PCR（qPCR）的效率。

方法：对dPCR的退火温度、退火时间、PCR循环次数等参数进行优化。我们还比较了dPCR和qPCR的性能。

结果：数字PCR测定尿液中外泌体miRNAs的最佳退火温度为59℃，退火时间为60s，最适循环数为45个。dPCR与qPCR相比具有更高的技术敏感性。dPCR检测miR29a的最低检出浓度为<50拷贝/μL（尿液），而qPCR的最低检测浓度为6473拷贝/μL（尿液）。此外，与qPCR相比，dPCR对连续稀释样品产生了更为一致的结果。dPCR产生的批内变异比qPCR小，但没有达到统计学意义。它还导致了更好的重复性和较小的运行之间的变化。

结论：尿液中外泌体miRNA-dPCR方法的优化依赖于实验退火温度和时间以及PCR循环次数等关键变量的评估。与qPCR相比，dPCR具有更高的灵敏度、重复性和准确性。

背景：

1.外泌体40-100nm的囊泡小体，可以从体液中分离出外泌体，比如血浆、尿液、唾液、痰液等样品。也可以从培养的细胞培养基中分离获得。外泌体的主要功能是作为细胞间的信使传递信号，成分包括膜蛋白受体、免疫球蛋白、核酸等物质。目前外泌体中鉴定的核酸包括mRNA、miRNA和其他非编码RNA（ncRNA）。 

2.大量研究表明miRNA可作为早期筛查的分子标志物，如miRNA1290和miRNA375可以作为前列腺癌的早期筛查分子标志物。

3.目前分子定量技术主要是qPCR，qPCR技术也可以实现miRNA的相对定量。但是尿液中miRNA的检测线较低，qPCR技术很难实现；并且qPCR检测miRNA表达，需要用内参作为参考，而尿液中miRNA缺少参考基因，很难准确实现定量；

实验结果：

1. 退火温度、退火时间和PCR扩增循环数影响阳性信号和背景信号图中蓝色和绿色为阳性信号，黑色为背景信号。酒红色的cut off线为区分阳性和背景信号的阈值线。

A，梯度退火发现，随着退火温度的降低阳性信号可以和背景信号分开，但是退火温度过低会导致PCR特异性降低，最后选择了退火温度为59℃。

B-E，退火时间和循环数试验。随着循环数的增大，荧光信号变强，阳性信号和背景信号分开。为了防止突变的产生，退火时间越短越好，最后选择了退火60s和45个循环。推荐的PCR扩增的升降温速率为2℃/s

2. 探针浓度影响阳性信号和背景信号的分离通过提高探针浓度，发现绿色的阳性信号会和黑色的背景信号分开，防止对结果的误判。

3. dPCR与qPCR相关性比较A, 比较qPCR和dPCR检测外泌体miRNA表达，qPCR只能检测出表达较高的miR-30c和miR-652，qPCR并不能检测出低水平的miR-29a。相反，dPCR除了可以检测出较高表达的miR-30c和miR-652之外，还可以检测出低水平的miR-29a。

B，miR-652预测值分别与dPCR，qPCR做相关分析，发现dPCR相关性更高。

4.数字PCR与qPCR稳定性比价通过比较dPCR与qPCR检测miR-30c与miR-652结果，实验结果表明数字PCR的CV值更低，说明数据重复性更好。

结论：

1.目前分子定量技术主要是qPCR，qPCR技术也可以实现miRNA的相对定量。但是尿液中miRNA的检测线较低，qPCR技术很难实现；并且qPCR检测miRNA表达，需要用内参作为参考，而尿液中miRNA缺少参考基因，很难准确实现定量。数字PCR不需要参考基因可以实现miRNA的绝对定量；数字PCR更适合尿液中检测低含量的外泌体miRNA。

2.数字PCR与qPCR相比，CV值小，数据重复性好；qPCR在定量时，会受时间节点的影响，导致检测结果不同，数字PCR不会因为时间节点的不同，导致检测结果不同。数字PCR的数据稳定性有保证。

参考文献：Droplet digital PCR improves urinary exosomal miRNAdetection compared to real-time PCR