利用CRISPR-Cas9技术敲除番茄中DMR6 直系同源物使其获得广谱抗病性学术资讯

植物病害是全球作物减产的主要原因之一，对全球粮食安全构成严重威胁。植物病害通常难以控制，需要采取综合的治理方法，包括适当的栽培方法、农药和培育抗性品种。抗性品种的开发通常依赖于抗性基因（R gene）的部署，而单个R基因介导的抗性通常缺乏持久性，因为病原体很容易丢失或突变其R基因的效应子。通过基因堆叠方法，引入多个R基因可有效提高植物的抗病持久性。同时也可通过对感病基因（S gene）的失活处理来实现，S基因可以促进病原体的感染和增殖能力。与叠加多个R基因相比，破坏单个S基因是实现作物广谱和持久抗病性的更快、更简单的策略。近日加州大学创新基因组学研究所Brian Staskawicz 课题组在PNAS上在线发表了题为 “Loss of function of a DMR6 ortholog in tomato confers broad-spectrum disease resistance” 的论文，通过CRISPR-Cas9技术敲除番茄中感病基因DMR6直系同源基因SlDMR6-1，使其获得广谱抗病性。

DMR6编码了一个2-氧代戊二酸Fe（II）依赖性加氧酶（2OGO），在病原菌感染期间上调表达。DMR6及其同源类似物DMR6-Like Oxygenase1（DLO1）是植物免疫的抑制因子，在病原体感染期间会共表达。番茄中有两个AtDMR6直系同源基因：SlDMR6-1 (Solyc03g080190.3) 和SlDMR6-2 (Solyc06g073080.4)。其中只有SlDMR6-1响应病原菌侵染，作者设计两个sgRNA分别靶向SlDMR6-1的外显子2和外显子3。利用农杆菌介导转化方法的获得了61株T0材料，其中有5株（8.2%）纯和突变体。作者对这些突变体的抗病能力进行检测发现，SlDMR6-1突变体对三种进化上不同的病原体的抗性均有显著增强。同时，再突变体中观察到抗性增强与SA水平升高相关，表明抗病性可能与SA介导的免疫反应的激活有关。

图1：番茄中的SlDMR6-1失活获得广谱抗病性

作者为了分析响应病原体感染的SlDMR6-1在植物免疫中起的作用，对三种不同基因型的番茄叶片进行转录组分析，结果表明与野生型相比，突变体中有大量的基因发生了差异表达。对这些差异基因进行GO富集发现，上调的DEG在与植物免疫相关的生物过程中富集，例如SA反应和先天免疫反应，因此表明即使在没有病原体的亲狂下植物防御也被激活。同时还有大量与发育相关的代谢途径受到抑制，但这些植物并没有表现出任何生长发育受阻现象。

图2：敲除SlDMR6-1，番茄转录组发生大规模重编程

为了研究SlDMR6-1和SlDMR6-2的酶学特性，将这两个基因克隆到pET28a载体中。将纯化后的蛋白质用于酶活测定，产物通过HPLC进行分析。在测试条件下，SA在AtDMR6存在下转化为2，5-DHBA,而当用柚皮素作为底物时，不会形成其他化合物。

图3：SlDMR6-1和SlDMR6-2催化SA转化为2，5-DHBA

综上所述：S基因DMR6可促进卵菌和细菌病原体感染植物体，在各种经济作物如番茄、可可和木薯等中保守存在。在番茄中仅SlDMR6-1可能在免疫反应中发挥作用。SlDMR6-1突变体具有广谱抗病表型，在突变体中抗性的获得与SA介导的激活相关联。田间实验也表明，SlDMR6-1突变体的抗性获得具有可重复性，未来的实验仍然需要评估SlDMR6-1突变体在田间条件下对健康未感染植物的影响。

来源：植物科学最前沿

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