Cohesin-CTCF锚定DNA环的结构基础

来源：BioArt

黏连蛋白（Cohesin）催化基因组折叠形成DNA环，而这些环被CTCF所锚定【1】。细胞间期的基因组会通过黏连蛋白以及CTCF的作用折叠成3D结构，这些结构因子与其他的调控因子相互作用从而调控基因的表达【2,3】。但是一直以来黏连蛋白以及CTCF是如何将基因组折叠形成3D基因组结构其中的分子机制还很不清楚。

2020年1月6日，欧洲分子生物学实验室（EMBL）Kyle W. Muir研究组以及荷兰癌症研究所Elzo de Wit、Benjamin D. Rowland研究组以及EMBL的Daniel Panne四个研究组联合在Nature加速发表题为“The structural basis for cohesion-CTCF anchored loops”的研究论文，从生物物理学、生物化学、生物信息学等多方面揭示了CTCF控制黏连蛋白环挤出（Loop extrusion）的结构基础与分子机制。

先前的研究发现CTCF通过直接与黏连蛋白复合物中的S2A组分相互作用【4】。为了进一步找到与CTCF相互作用的组分，作者们进行了CTCF的短截片段的GST-pulldown实验，发现了CTCF包含227-235aa（Amino acid）的片段能够与SA2-SCC1相互作用。进一步地，作者们通过解析蛋白质结构发现，CTCF肽段结合在SA2的凸面，而且CTCF结合表面主要是由SA2和SCC1共同贡献的疏水性的氨基酸，CTCF锚定氨基酸的是Y226以及F228（图1）。该晶体结构的分辨率为2.6 Å。

图1 SA2-SCC1-CTCF复合物的结构解析

得到了该复合物结构之后，作者们进一步分析了CTCF与黏连蛋白的结合界面。通过将CTCF的锚定氨基酸进行Y226以及F228进行突变后发现，CTCF与SA2-SCC1的相互作用完全被破坏。SA2中包含一个86aa的基序，被称为Conserved essential surface(CES)，CES从真菌到哺乳动物都是高度保守的，并且是CTCF结合口袋（CTCF binding pocket）区域。研究发现，在很多癌细胞中SA2、SCC1以及CTCF有很多氨基酸的突变【5】，通过晶体结构解析之后发现这些重要的氨基酸大部分都在相互作用界面。

之前的研究发现SA2-SCC1复合物会与多种黏连蛋白的调节因子相互作用。其中，最重要的两个具有相反作用的因子是黏连蛋白释放因子WAPL，以及在有丝分裂期间保护着丝粒处黏连蛋白的调控因子Shugoshin(SGO1)【6,7】。由于观察到CTCF与WAPL可以结合在SA2-SCC1相同界面，作者们提出了一个假设：CTCF、WAPL各自与CES的相互作用可能是互斥的（图2a）。通过GST-pulldown竞争实验作者们发现SGO1通过排除有丝分裂期WAPL的结合促进着丝粒处黏连蛋白的稳定，而CTCF通过相似的方式在细胞间期发挥作用。

为了进一步检测CTCF-CES的相互作用是否会稳定染色质上黏连蛋白的结合，作者们通过CRISPR/Cas9技术，建立了包含Y226以及F228锚定位点氨基酸的突变体细胞系。通过对黏连蛋白SCC1增加荧光标记，再对野生型以及突变型的细胞中的SCC1分别进行荧光漂白实验（Fluorescence recovery after photobleaching, FRAP）后发现，野生型CTCF细胞中黏连蛋白在荧光漂白后几乎不能恢复，而在相同时间内，突变型CTCF细胞中的黏连蛋白几乎均分布（图2c）。这说明在突变型细胞中黏连蛋白变得更加具有动态性，CTCF-CES的相互作用稳定了染色质上黏连蛋白的结合。

图2 CTCF的结合促进DNA上黏连蛋白的稳定存在

随后作者们希望通过Hi-C实验进一步确认黏连蛋白与CTCF之间相互作用对于染色体组织的作用，发现在突变型细胞中DNA环的形成明显减少。CTCF位点不仅是CTCF锚定DNA环的基础，也是TADs(Topologically associating domains)边界形成的基础。作者们发现，在突变型细胞中TADs类似的结构虽然还存在但是TADs的边界变得不清晰。

为了进一步确认CTCF-CES的相互作用对于黏连蛋白在DNA环锚定区域的存在丰度是否有影响，作者们进行了ChIP-qPCR的实验，发现在突变型细胞中，黏连蛋白在这些位点的丰度明显下降，而对于不相关的位点则没有明显的变化。

图3 CTCF与SA2-SCC1结合DNA的模型图

总的来说，该研究解析了CTCF结合在SA2-SCC1复合物关键保守表面CES的晶体结构，并通过进一步的实验发现，该相互作用界面对于CTCF与黏连蛋白锚定的DNA环的形成具有非常关键的作用。CTCF不仅提供了黏连蛋白调节的环挤出的边界，还通过与CES的特异性相互作用，稳定了在这些位点上黏连蛋白的结合，并且阻止了对DNA环的破坏（图3）。本研究解析CTCF与黏连蛋白的相互作用机制，并解释了该相互作用对于基因组3D结构形成的重要性。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1910-z

参考文献

1 Merkenschlager, M. & Nora, E. P. CTCF and Cohesin in Genome Folding and Transcriptional Gene Regulation. Annual review of genomics and human genetics 17, 17-43, doi:10.1146/annurev-genom-083115-022339 (2016).

2 Alipour, E. & Marko, J. F. Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes. Nucleic acids research 40, 11202-11212, doi:10.1093/nar/gks925 (2012).

3 Yatskevich, S., Rhodes, J. & Nasmyth, K. Organization of Chromosomal DNA by SMC Complexes. Annual review of genetics 53, 445-482, doi:10.1146/annurev-genet-112618-043633 (2019).

4 Pezzi, N. et al. STAG3, a novel gene encoding a protein involved in meiotic chromosome pairing and location of STAG3-related genes flanking the Williams-Beuren syndrome deletion. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 14, 581-592, doi:10.1096/fasebj.14.3.581 (2000).

5 Beckouet, F. et al. Releasing Activity Disengages Cohesin's Smc3/Scc1 Interface in a Process Blocked by Acetylation. Molecular cell 61, 563-574, doi:10.1016/j.molcel.2016.01.026 (2016).

6 Kueng, S. et al. Wapl controls the dynamic association of cohesin with chromatin. Cell 127, 955-967, doi:10.1016/j.cell.2006.09.040 (2006).

7 Liu, H., Rankin, S. & Yu, H. Phosphorylation-enabled binding of SGO1-PP2A to cohesin protects sororin and centromeric cohesion during mitosis. Nature cell biology 15, 40-49, doi:10.1038/ncb2637 (2013).