高璞/高光侠合作揭示锌指抗病毒蛋白ZAP识别RNA的分子机制

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病毒感染机体引发多种疾病。为对抗病毒的入侵，宿主进化出多种抗病毒蛋白抑制病毒复制。研究抗病毒蛋白的作用机理对深入了解病毒与宿主相互作用具有重要意义，同时可为临床防控提供理论基础。

锌指抗病毒蛋白ZAP最早由高光侠研究员于2002年在大鼠细胞中发现，对小鼠白血病病毒的复制具有抑制作用【1】。随后的研究发现，ZAP特异性抑制多种疾病相关病毒在宿主细胞内的复制，包括艾滋病病毒（HIV）【2】、埃博拉病毒【3】、流感病毒【4】等。ZAP可特异性结合病毒的mRNA序列，干扰相关基因的翻译起始。随后ZAP招募细胞内一系列RNA降解机器，包括脱polyA酶PARN、脱帽酶Dcp2、RNA解旋酶p72、核酸外切酶复合体Exosome等来降解病毒mRNA【2,5,6】。

中科院生物物理研究所刘迎芳课题组和高光侠课题组曾在Nature Structural & Molecular Biology上报道了ZAP蛋白抗病毒区域的晶体结构【7】。ZAP发挥其抗病毒功能的区域主要是其N端结构域，结构表明ZAP含有四个潜在结合RNA的CCCH类型锌指结构。然而，ZAP识别RNA的序列特征却一直不清楚。2017年 Rockefeller 大学Paul D. Bieniasz实验室在Nature文章中报道，ZAP能够特异识别富含CG的RNA序列【8】，这可能是机体在长期进化中形成的对抗感染的重要机制。那么ZAP是如何识别CG二核苷酸？除CG二核苷酸之外，ZAP是否还能结合其他的RNA元件？再有，ZAP 主要抗病毒功能域仅有200多个氨基酸，是如何协调下游多个相互作用蛋白发挥功能？这些都是函待回答的重要科学问题。

2020年1月7日，高璞课题组与高光侠课题组合作在Cell Reports杂志上发表了研究论文 Molecular Mechanism of RNA Recognition by Zinc-finger Antiviral protein 。该研究工作解析了ZAP N端抗病毒结构域与富含CG的单链RNA复合物的高分辨率晶体结构，并配合针对性的生化及细胞实验，揭示了ZAP识别单链RNA中多个特异性序列元件的分子基础。

研究人员设计了一系列ZAP蛋白截短体及不同序列和长度的单链RNA，并对多种ZAP-RNA复合物进行了大量晶体筛选， 最终得到了分辨率为2.19Å 的ZAP N端结构域与6-nt（CGUCGU）单链RNA的复合物结构。结构表明，RNA分子是将其碱基，而非磷酸核糖骨架，插入到ZAP富含正电荷的口袋中，这种互作特点也明确了ZAP只能结合单链RNA，而非双链或其他高级结构的RNA。与apo结构相比，ZAP与RNA的结合使其四个锌指结构（ZF1-4）均发生了显著的构象变化。意料之外的是，研究人员不仅发现了CG二核苷酸的结合位点（主要位于ZF2），还鉴定了ZAP特异性结合单独C（ZF3和ZF4）和单独G（ZF3）的两个RNA结合口袋。ZAP蛋白的特殊结构特点保证了上述的碱基序列识别都是高度特异的。

图1：ZAP抗病毒的机制模型及ZAP-RNA复合物的结构

基于结构信息，研究人员利用ITC实验测定了ZAP与多种不同序列单链RNA的结合强度，筛选到最适合与ZAP互作的RNA motif，即C(n7)G(n)CG，并通过细胞水平的抗病毒实验确证了该motif的重要性。随后，研究人员在ZAP蛋白上构建了一系列突变，通过体外的EMSA结合实验和细胞内的抗病毒功能分析，明确了在结构上发现的ZAP-RNA互作位点确实对ZAP的RNA结合和抗病毒功能有重要作用。

同时研究者还发现，如果RNA上存在多个ZAP-binding motif，该RNA可同时结合多个ZAP分子。由此可以推测，多个ZAP蛋白结合在同一条RNA上的不同ZAP-binding motif上，并分别招募不同的下游细胞因子，协同发挥RNA降解功能（图1）。

综上，作者解析了ZAP与靶RNA复合物的晶体结构，筛选到ZAP最适结合的RNA motif C(n7)G(n)CG，并结合功能分析揭示了ZAP识别RNA的分子机制。该工作对深入了解ZAP的抗病毒机制及真核基因表达调控机制具有重要意义，同时为今后鉴定更多ZAP靶向的病毒及宿主mRNA奠定了基础。

据悉，该工作是由中科院生物物理研究所高璞课题组和高光侠课题组共同合作完成。高璞研究员和高光侠研究员为本文的通讯作者。高璞课题组的博士研究生骆秀和高光侠课题组的副研究员王新路为文章的共同第一作者。上海光源在晶体衍射数据收集过程中给予了帮助，生物物理研究所平台的陈媛媛博士在ITC实验方面给予了大量的帮助。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.11.116

制版人：珂

参考文献

1. Gao, G., Guo, X., and Goff, S.P. (2002). Inhibition of retroviral RNA production by ZAP, a CCCH-type zinc finger protein. Science 297, 1703-1706.

2. Zhu, Y., Chen, G., Lv, F., Wang, X., Ji, X., Xu, Y., Sun, J., Wu, L., Zheng, Y.T., and Gao, G. (2011). Zinc-finger antiviral protein inhibits HIV-1 infection by selectively targeting multiply spliced viral mRNAs for degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 15834-15839.

3. Muller, S., Moller, P., Bick, M.J., Wurr, S., Becker, S., Gunther, S., and Kummerer, B.M. (2007). Inhibition of filovirus replication by the zinc finger antiviral protein. Journal of virology 81, 2391-2400.

4. Tang, Q.N., Wang, X.L., and Gao, G.X. (2017). The Short Form of the Zinc Finger Antiviral Protein Inhibits Influenza A Virus Protein Expression and Is Antagonized by the Virus-Encoded NS1. Journal of virology 91, pii:e01909-01916.

5. Zhu, Y.P., and Gao, G.X. (2008). ZAP-mediated mRNA degradation. Rna Biol 5, 65-67.

6. Zhu, Y.P., Wang, X.L., Goff, S.P., and Gao, G.X. (2012). Translational repression precedes and is required for ZAP-mediated mRNA decay. Embo J 31, 4236-4246.

7. Chen, S.D., Xu, Y.H., Zhang, K., Wang, X.L., Sun, J., Gao, G.X., and Liu, Y.F. (2012). Structure of N-terminal domain of ZAP indicates how a zinc-finger protein recognizes complex RNA. Nature structural & molecular biology 19, 430-435.

8. Takata, M.A., Goncalves-Carneiro, D., Zang, T.M., Soll, S.J., York, A., Blanco-Melo, D., and Bieniasz, P.D. (2017). CG dinucleotide suppression enables antiviral defence targeting non-self RNA. Nature 550, 124-127.