新方法！南科大翟继先组开发出单分子水平全长新生RNA分析方法FLEP-seq 学术资讯

近日，南方科技大学生命科学学院副教授翟继先团队结合三代测序技术，开发出一套能同时检测PolyA信息，Pol II转录位置和多内含子剪接情况的高通量全长单分子测序技术（图1）。相关技术已成功用于拟南芥转录及剪接相关研究，并以“FLEP-seq: simultaneous detection of RNA polymerase II position, splicing status, polyadenylation site, and poly(A) tail length at genome-wide scale by single-molecule nascent RNA sequencing”为题发表在国际知名方法学领域期刊Nature Protocols。

Pre-mRNA的加工和成熟是真核生物基因表达调控的重要步骤。从转录合成开始，至输出细胞核并在细胞质中翻译之前，pre-mRNA会通过一系列复杂的分子反应，包括5'端帽子的添加，内含子的剪切和3'端末端的多聚腺苷酸化。在真核生物中，大多数内含子都以共转录剪切的方式进行，在转录完成之前就已被去除。目前，剪切因子的招募以及剪接体的结构和组装过程已解析得比较清楚，但剪切动力学、共转录剪切的具体进程和3'末端加工过程仍有待进一步研究。

近年来，随着测序技术的发展，以Nanopore和PacBio为代表的三代测序技术逐渐成熟。二者产出的平均测序读长在kb级别，甚至高达几十kb，相比Illumina等二代测序平台bp级别的读长，优势明显。三代文库构建时无需将基因组/转录本打断，信息分析无需对测序片段进行组装，即可精准重构基因组和转录组全貌。目前在高重复和高杂合基因组组装、可变剪切位点鉴定、融合基因和大片段结构变异等研究中得到了越来越多的应用。将三代测序技术运用于转录加工过程的研究，不仅可区分每种类型的转录异构体，还能直接对每一条新生RNA上的每个内含子在转录过程中的剪接进程、转录终止过程中的polyA加尾和末端加工过程进行观察。

图1. FLEP-seq流程示意图

研究团队开发的方法能捕获包括Pol-II延伸过程中的转录本、已转录过polyA位点的read through转录本、以及已完成或正在进行加A的转录本在内的多种RNA转录、剪切和加工中间体，并同时对每个RNA分子上的内含子剪切状态、Pol-II转录位置、polyA位置以及polyA长度等信息进行检测（图2）。这为研究人员追踪并研究植物mRNA转录、剪切和加工的动态过程提供了重要的新工具。