周顺桂教授课题组：除草剂暴露加速农田土壤中抗生素抗性基因传播研究学术资讯

除草剂在全球广泛用于控制农业生产中的杂草。虽然多数除草剂的靶标基因多数是植物特有，但部分作用位点通过基因保守位点进化与基因漂移对其他生物造成附带的作用。譬如，除草剂草甘膦的作用的分子靶标基因——抑制莽草酸途径的芳香氨酸的生物合成；最近研究表明该基因也存在于部分细菌和真菌中。目前发现除草剂的长期使用与暴露，通过影响昆虫、小鼠和植物体内宿主微生物组成改变了非植物宿主的代谢功能，但除草剂长期施用对土壤微生物功能代谢，特别是耐药基因的影响尚不清楚。抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）作为一种新型生物污染物，对土壤生态系统健康与安全造成严重威胁。然而，除草剂胁迫是否影响土壤微生物群落ARGs增殖和传播依然未知。本研究针对除草剂胁迫对土壤微生物ARGs影响及传播机制不明确，以三种常用除草剂（草甘膦、草铵膦和麦草畏）为代表，通过微宇宙模拟试验和全国田间土壤调查试验，解析了除草剂促进对土壤中ARGs富集的影响，从基因突变和水平基因转移分子角度阐明除草剂促进土壤中ARGs传播扩散的作用机制。研究结果为理解非抗生素类物质促进ARGs传播扩散提供了新的视角。

通过为期60天的微宇宙模拟试验中研究了除草剂对细菌群落和ARGs与MGEs丰度的影响。通过16S rRNA扩增子测序发现，3种除草剂对细菌总丰度均无显著影响（图1a），虽然草铵膦显著改变了土壤中少数细菌的丰度（图1b），但环境浓度的除草剂（10 mg/kg）对土壤细菌的丰富度、α多样性和组成（图1c-d）均无显著影响，这些结果表明除草剂对土壤微生物丰度和组成的影响很小。

图1 除草剂暴露对土壤中微生物群落影响

土壤微宇宙模拟试验表明，除草剂暴露显著增加了土壤中ARGs和MGEs数量及丰度。土壤中ARGs和MGEs可检测数量分别从550和27个增加到768和44个（图2a），总ARGs和MGEs丰度分别增加了3.1-9.0和2.0-8.8倍（图2b-c）。并且，ARGs 和 MGEs 的丰富度和 Chao1 指数（图2d）均显示出增加的趋势，以上结果表明除草剂暴露增加了土壤中ARGs 和 MGEs 的相对丰度、数量以及多样性。

图2 除草剂暴露增加土壤中ARGs和MGEs数量与丰度

为了探究潜在机制，我们以大肠杆菌为模式菌株，通过除草剂暴露进化试验研究了除草剂是否诱导细菌基因突变产生ARGs。首先验证除草剂暴露（2-50 mg/L）对细菌生长无显著影响，在30 d的进化试验中3种除草剂均诱导无抗生素抗性的大肠杆菌进化为抗生素耐药菌。与无除草剂处理的菌株相比，突变菌株的抗生素抗性和除草剂抗性均显著增强（图3a-b）。全基因组测序表明除草剂通过诱导细菌膜蛋白（ompF）、菌毛蛋白（yraH）等与抗生素抗性相关的基因和假尿苷激酶（psuK）、谷胱甘肽结合蛋白（gsiB）等与除草剂抗性相关的基因发生突变（图3c），从而诱导细菌产生耐药性。同时，我们通过水平基因转移试验探究了除草剂是否影响多重耐药质粒RP4的HGT，结果显示除草剂显著促进了多重耐药质粒RP4在细菌属间（E. coli→Bacillus/Pseudomonas）和属内（E. coli→E. coli）转移（图3d-f）。后续实验结果表明除草剂通过增加供体和受体细胞膜通透性（图3g），促进质粒从供体转移至受体加速抗性基因传播扩散。以上结果表明除草剂可通过促进细菌基因突变和水平转移从而加速ARGs在环境中广泛传播。

图3 除草剂暴露对de novo 耐药性进化和多重耐药质粒水平转移的影响

此外，在中国11个省份的农业土壤中也发现了类似的现象，其中除草剂的施用和土壤中残留草甘膦浓度与增加的ARG和MGE丰度有关。总之，研究结果表明除草剂的应用可以通过改变土壤微生物组的遗传组成来富集ARGs和MGEs，这可能会导致农业环境中的全球抗生素耐药性问题。

本研究来自福建农林大学资源与环境学院周顺桂教授课题组。近期以“Herbicide selection promotes antibiotic resistance in soil microbiomes”为题在线发表于国际著名期刊Molecular Biology and Evolution（IF2020= 16.24，中科院1区）。福建农林大学为第一完成单位，廖汉鹏副教授为论文第一作者，周顺桂教授与英国约克大学Ville-Petri Friman教授为共同通讯作者，该研究得到了国家自然科学基金（31972521）、国家重点研发计划项目（2017YFD0800203）的资助和福建农林大学杰出青年基金项目（XJQ2017001）资助。据悉，近期该课题组在新型污染物耐药基因相关研究在取得一系列突破与进展，成果发表于Environmental Science & Technology，Environmental Microbiology，Environment International 等环境领域重要期刊。