重大进展，David Liu首次通过AAV病毒载体在动物体内进行碱基编辑作用

来源：iNature

碱基编辑器用于研究和治疗遗传性疾病的成功取决于将其体内传递给相关细胞类型的能力。通过腺相关病毒（AAV）的传送受AAV打包能力的限制（AAV的基因组包装大小限制为≤5kb），因此无法使用全长碱基编辑器。

2020年1月14日，博德研究所David Liu团队在Nature Biomedical Engineering 在线发表题为“Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses”的研究论文，该研究报告了双重AAV的应用，用于传递分开的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，然后再通过反式 inteins剪接重构。 优化的双重AAV可以在小鼠大脑（多达59％的未分类皮质组织），肝脏（38％），视网膜（38％），心脏（20％）和骨骼肌（ 9％）的编辑效率。该研究还表明，碱基编辑可以纠正小鼠脑组织中的突变，该突变引起Niemann–Pick疾病C型（NPC）（一种神经退行性共济失调），同时减慢神经变性并延长寿命。  总而言之，此处开发的分裂蛋白质碱基编辑器递送系统具有碱基编辑的优势，包括较高的编辑效率，最小化双链DNA断裂产生的有害副产物以及与有丝分裂后体细胞在体内的相容性。另外，对于递送较大的DNA片段，具有明显的优势。

点突变代表了大多数已知的人类致病基因变异。为了能够在活细胞中直接诱导或纠正点突变，研究人员开发了碱基编辑器-工程化蛋白质，可以直接将目标碱基对转换为不同的碱基对，而不会产生双链DNA断裂。诸如BE4max之类的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）催化将目标C•G碱基对转化为T•A，而诸如ABEmax之类的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）将目标A•T碱基对转化为GC。

尽管CBE和ABE在许多培养的哺乳动物细胞系统中都得到了广泛使用并能有效发挥作用，但仍难以将碱基编辑器有效地运入活体动物中。动物中碱基编辑器传递的主要障碍是无法将碱基编辑器包装在腺相关病毒（AAV）中。DNA编码碱基编辑器的大小较大（对于含有化脓链球菌Cas9的碱基编辑器，为5.2kb），而无法包装到AAV中（AAV的基因组包装大小限制为≤5kb）。

载体构建

为了绕过这种包装尺寸的限制并使用AAV提供碱基编辑器，研究人员设计了一个拆分的双重碱基编辑器-AAV策略，其中CBE或ABE分为氨基末端和羧基末端。在表达每个碱基编辑器的两个片段被AAV颗粒共感染后，反式剪接的蛋白质重新构成了全长碱基编辑器。与其他利用小分子或单个向导RNA（sgRNA）桥接拆分Cas9的方法不同，内含肽剪接可去除所有外源序列并在拆分位点再生天然肽键，从而产生与未经修饰的碱基编辑器序列相同的单个重组蛋白。

在这项研究中，研究人员开发了split-intein CBE和split-intein ABE，并将它们整合到优化的双AAV基因组中，从而使迄今为止在治疗相关的体细胞组织（包括肝脏，心脏，肌肉，脑，视网膜和皮肤）中最有效的碱基编辑成为可能。

研究人员使用所得的AAV在CBE和ABE的测试基因座处实现了有效碱基编辑效率，在每个组织中，ABE剂量达到或超过治疗相关的编辑阈值，以已知的AAV剂量治疗某些人类遗传性疾病在人类中耐受良好。该研究报告了双重AAV的应用，用于传递分开的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，然后再通过反式 inteins剪接重构。 优化的双重AAV可以在小鼠大脑（多达59％的未分类皮质组织），肝脏（38％），视网膜（38％），心脏（20％）和骨骼肌（ 9％）的编辑效率。 该研究还表明，碱基编辑可以纠正小鼠脑组织中的突变【该突变引起Niemann–Pick疾病C型（NPC）（一种神经退行性共济失调）】，同时减慢神经变性并延长寿命。 

总而言之，此处开发的分裂蛋白质碱基编辑器递送系统具有碱基编辑的优势，包括较高的编辑效率，最小化双链DNA断裂产生的有害副产物以及与有丝分裂后体细胞在体内的相容性。另外，对于递送较大的DNA片段，具有明显的优势。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41551-019-0501-5