华中农大利用高通量靶向基因编辑可加速玉米功能基因挖掘

来源：植物科学最前沿

近日，华中农大严建兵教授及国内外多家合作单位研究成果以“High throughput CRISPR/Cas9 mutagenesis streamlines trait gene identification in maize”为题在The Plant Cell期刊发表，研究提出构建基于先验知识的靶向突变体库（knowledge-driven targeted mutagenesis），可以大大加速功能基因的挖掘。

挖掘影响重要性状的基因是作物遗传改良的关键路径之一。然而，当前基因克隆的方法大多费时费力、效率较低，难以满足全球日益增长的对粮食总量及营养品质提升的需求。当前挖掘功能基因主要有两种方法：一是构建各种群体通过连锁或关联分析进行遗传定位，二是借助随机突变体库通过对表型的大规模筛选进而鉴定功能基因。遗传定位十分耗时耗力，即便被寄予厚望的关联分析也很难达到预期单基因水平的精度，依旧需要发展新的群体进行精细定位，且发展的特定群体一般仅能针对特定性状的特定QTL（Quantitative Trait Locus）；基于生物、化学乃至物理技术所构建的突变体库已被广泛用于作物基因挖掘，然而这一方法常常需要群体大面积种植后进行目标表型筛选而缺少针对性，即便筛选到目标表型由于单个突变植株往往携带数十个乃至上百个突变位点，依旧需要进一步发展群体进行功能基因筛选及验证。这些不足造成当前基因克隆整体效率较低，无法通量化，成本较高。

近年来CRISPR/Cas9系统由于靶向性及特异性非常高、操作简单快捷等优势已被广泛用于各种物种的基因编辑，并已在水稻和大豆中实现了大规模的突变体资源的创制。但这些大规模基因编辑的研究主要将CRISPR/Cas9作为传统突变手段的替代品，如何针对植物特性完善从靶标设计到突变序列检测全流程的高通量体系、降低成本、挖掘这一新兴技术应用后对基因组影响的规律等缺乏深入研究。特别是由于玉米基因组庞大复杂、可稳定转化的品系有限、转化效率较低等问题，以玉米为代表探索建立相应体系更具挑战性，也更具广泛借鉴性。

本研究中作者提出了综合传统遗传定位和高通量靶向基因编辑加速玉米功能基因挖掘的思路，这一设想在于充分利用CRISPR/Cas9高度特异和靶向性的同时，借助先前的定位线索为每一个靶向基因提供预期的潜在表型。该研究包括三方面亮点：

一是探索并完善了基于CRISPR/Cas9的高通量的技术体系，大大降低了成本。例如，课题组前期完成了适用于非参考基因组高通量设计sgRNA的流程；完成了覆盖目标基因所需转化事件的设计和模拟分析；通过改进MassARRAY和靶向捕获测序技术实现高通量和低成本的靶标突变序列鉴定。

二是基于先验知识的靶向突变体库是玉米功能基因挖掘的有益资源。研究人员利用近期CUBIC群体所获大量初定位QTL及其它重要候选基因，进行了一千多个候选基因的大规模实验。通过调查QTL区间所有基因突变体的表型就可以鉴定到功能基因，省去了繁杂的精细定位过程。研究人员不仅利用所获靶向突变体库对遗传定位的共验证，还分析了同一QTL鉴定到多个功能基因、更丰富的非预期突变表型的获得、基因冗余导致编辑后未有预期表型等多个案例，揭示了传统基因定位克隆手段难以发现的科学现象和规律，展现了这一靶向突变体库的重要价值。

三是增加了对植物基因编辑规律的认识。本研究发现植物基因编辑突变谱与人类细胞系一样，且具有较高的可预测性。目标基因的表达模式对编辑产物有显著影响。此外，该研究还发现一定频率的以体内异源（不同染色体）模板进行同源重组介导的基因修复（homology-directed repair）现象，为基因敲入提供了新的思路。研究人员指出作物基因编辑过程中的脱靶频率很低，但嵌合现象以及由于基因冗余带来的额外靶点的存在值得高度重视。

同期的The Plant Cell杂志以“作物大规模基因组编辑的路线图(A Roadmap Toward Large-Scale Genome Editing in Crops)”为题配发评论，认为作者漂亮地展示了如何利用新的工具来进行基因发现和验证，总结了多个应用场景，并称该方法为“暴力破解方法（Brute-force approaches）”。

论文链接：

http://www.plantcell.org/content/early/2020/02/25/tpc.19.00934