Sci Adv：徐晓雷团队探索控制抗癌药物诱导心脏毒性的有效机制

来源：BioArt

蒽环霉素，诸如多柔比星(doxorubicin)，是一类目前临床上被广泛应用于多种癌症治疗的有效药物。然而由于蒽环霉素本身具有很强的心脏毒性，临床称之为“蒽环霉素诱导心脏毒性”（anthracycline-induced cardiotoxicity, AIC），很多接受了蒽环霉素治疗的癌症病人在癌症症状得以缓解的同时却诱发了严重心肌病，甚至导致心力衰竭和死亡【1】。据估计，被诊断出AIC的癌症病人两年的死亡率约在50%左右【2】。因此，寻求有效的AIC治疗方法是癌症领域和心血管领域共同且迫切的研究方向。

另一方面，AIC的发病在人群中表现出了极强的个体差异，也给AIC的预防和治疗都带来了更大的难度。不同的癌症病人在接受了相同剂量的蒽环霉素治疗后表现出的AIC发病与否，发病时间和发病程度都不相同。由此推断，在人的基因组上存在AIC症状的修饰基因，而个体基因差异可以在很大程度上会影响AIC的发病。然而目前对这些潜在的修饰基因认识非常有限，如何快速找出这些潜在的AIC修饰基因，以及如何针对这些基因设计疗法，都成为了研究的难点。

来自美国明尼苏达州梅奥诊所的徐晓雷教授研究组，多年致力于心血管疾病的遗传学研究。2011，他们首次通过腹腔注射与临床相关的高剂量多柔比星，在成年斑马鱼上建立了AIC研究模型（Ding，et al， Circulation Research，2011）【3】。同年，徐晓雷团队与合作者一起利用“基因断裂转座子”（gene-break transponson, GBT）系统，在斑马鱼中建立了全基因组系统性基因敲除平台（Clark，et al，Nature Methods，2011）【4】。不同于普通的基因突变，每一个GBT斑马鱼系：（1）有且只有一个基因被突变；（2）被突变的基因被红色荧光所标定；（3）每个突变都可以被系统性或者条件性地回复。2016，徐晓雷团队开创性地将成年斑马鱼AIC模型和GBT系统相结合，建立了高效的AIC修饰基因筛查平台，首次实现了以正向遗传学为基础对AIC修饰基因在基因组水平上的系统性鉴定（Ding，et al，JCI insight，2016）【5】。通过对609个不同的GBT突变系的筛查，发现了四个全新的AIC修饰基因，其中三个基因的突变导致AIC病症的恶化，而另一个基因（发现于编号为GBT0419的鱼系），retinoid X receptor alpha （RXRA），的突变使得斑马鱼对AIC产生了保护作用。

近日，徐晓雷教授研究组在Science Advances上在线发表题为“Retinoid X receptor alpha is a spatiotemporally predominant therapeutic target for anthracycline-induced cardiotoxicity”的研究论文。该研究对以RXRA为基因靶标的AIC疗法的分子机制和细胞学机制进行了深入阐释，揭示在心肌内皮细胞上特异性激活RXRA基因功能可以有效地改善AIC症状。该研究报道了两种RXRA激活剂，异维甲酸和贝沙罗汀，可潜在应用于对AIC的早期阶段的治疗。

徐晓雷团队前期的工作已经证实GBT0419鱼系（带有RXRA有益突变，位于斑马鱼通源基因rxraa）可以显著降低成年斑马鱼AIC模型的长期病死率5。在此项研究中，基于GBT突变系的可回复性，研究人员首先利用多种CreER－loxP组合在组织学水平上对此RXRA有益突变的有效细胞类型进行定位 （图 1）。通过在心脏内皮细胞（利用kdrl：CreER鱼系），心肌细胞（利用cmlc2:CreER鱼系）和心脏外皮细胞（利用tcf21:CreER鱼系）分别对此突变实现特异性回复，研究者发现只有在心脏内皮细胞上的突变回复才会让该鱼系失去对AIC的保护作用。当有益突变在心脏内皮细胞被回复后，GBT0419鱼系在AIC模型上的表现为病死率升高，心功能降低，以及运动能力变差。与之相反，在心肌细胞和心脏外皮细胞上对RXRA有益突变进行回复，均不影响GBT0419鱼系对AIC的保护作用。由此证明，GBT0419所携带的RXRA有益突变主要是在心脏内皮细胞上发挥AIC保护作用，而在心肌细胞和心外皮细胞上的作用相对而言并不重要。

研究者进一步探讨GBT0419上所带突变是属于RXRA的功能获得性 （gain-of function）还是功能缺失性（loss-of function）突变。他们首先利用了TALEN基因编辑技术建立了一个rxraa基因缺失鱼系作为对照。与GBT0419鱼系不同，RXRA基因缺失鱼系不但没有对AIC的保护作用，反而有比野生型更高的病死率和更为严重的心肌病病理变化，具体表现为心肌细胞凋亡增多，心功能降低，心衰指标上升，以及肌小结结构破坏更严重等。这一结果提示GBT0419上所带突变并非RXRA功能缺失性突变。另一方面，研究者通过RNA水平表达量的测定，发现在GBT0419中rxraa自身的mRNA水平上升，且与之相关的视黄酸通路的靶标的表达水平也有所上升。同时，用视黄酸通路的抑制剂对GBT0419进行长期干预也可以降低其对AIC的保护作用。由此证明，GBT0419鱼系所带的RXRA有益突变更像是一种功能获得性突变，其带来的对于AIC的心脏保护在一定程度上是通过激活了视黄酸通路而实现的。

研究者随后又从另一方面对此推断进行验证 。他们通过转基因技术建立了rxraa基因的条件过表达鱼系。利用之前提到的kdrl：CreER，cmlc2:CreER和tcf21:CreER三个鱼系，研究者分别将rxraa在心脏内皮细胞，心肌细胞和心脏外皮细胞进行了过表达（图2）。通过后续实验，研究者直接地证明了rxraa的功能获得性改变会对AIC产生保护作用。与之前结果一致，研究者发现相对于心肌细胞和心脏外皮细胞而言，将rxraa过表达于心脏内皮细胞可以最有效地降低AIC模型的病死率，提高其心功能和运动能力。

图2 RXRA斑马鱼同源基因（rxraa）在心肌细胞（cmlc2+）和在心脏内皮细胞（kdrl+）的过表达系统

紧接着，研究者开始寻找以RXRA为靶点的AIC潜在治疗药物。先是利用一个高通量的胚胎斑马鱼AIC模型【6】对已商品化的RXRA激活剂进行了药物初筛，找到了三个可能对AIC起心脏保护的激活剂。针对其中两个已经被FDA批准上市的药物，异维甲酸和贝沙罗汀，研究者在成年斑马鱼AIC模型中进行了进一步验证。他们根据AIC模型的疾病表型的不同划分了三个不同的给药阶段：多柔比星注射前1周（预防阶段），多柔比星注射后1-4周（早期阶段，心功能无明显变化）和多柔比星注射后5-8周（晚期阶段，心功能出现明显下降）。通过对病死率和对心功能的检测，研究者发现相对于另外两个阶段，在早期阶段用异维甲酸或贝沙罗汀对AIC模型进行干预，可以达到最好的治疗效果。

最后，研究者对于以RXRA为靶点的AIC疗法在心脏内皮细胞和早期病发阶段的特异性从机制上给出了一种解释。通常情况下，多柔比星等蒽环霉素进入人体后会随着血液循环到达心脏，并通过破坏或穿透由心血管内皮结构构成的保护屏障到达心肌细胞，造成心肌细胞凋亡而诱发心肌病【7】。而心血管内皮的屏障功能主要是通过心脏内皮细胞间的紧密相连实现的。研究者发现用多柔比星对体外培养的人冠状动脉的内皮细胞进行处理会造成参与紧密连接（tight junction）结构之一的蛋白ZO－1（由TJP1基因编码）表达水平降低，而同时加入RXRA激活剂可以相反的促进ZO－1的表达。

通过分离成年斑马鱼AIC模型的心脏内皮细胞，研究者也发现RXRA激活剂可以在促进TJP1斑马鱼同源基因在RNA水平上的表达。通过对成鱼心脏切片进行免疫荧光染色，可以看到在AIC模型早期由内皮细胞Zo－1蛋白形成的规律网状结构被破坏，而同时期利用RXRA激活剂进行干预则可以抑制这种结构变化。类似的现象也在体外培养的人内皮细胞中得到证实。最后研究者利用了一个体外细胞渗透实验进一步证明了RXRA激活剂可以提升人内皮细胞对多柔比星的屏障作用（图3）。

总体来说，这项工作报道了RXRA可以作为有个有效的AIC治疗靶点，并提示后对以RXRA为靶点的AIC疗法研究和转化工作需要考虑其疗效在时间上和空间上的双重特异性，为随后的基因精准疗法打下基础。同时这也是第一个通过正向遗传学手段发现的AIC基因治疗靶点。

本文的第一作者梅奥诊所博士生马潇介绍：“我们希望能够为AIC病人找出尽可能多的可行的治疗靶点，同时也希望充分得利用模式生物中的一些前沿技术来促进这些发现往临床上的转化的可能。很多时候，药物或疗法的临床使用不仅要知道原理，还需要知道最合适的干预部位和干预时间，从而使得疗效最大化同时避免副作用。这里我们用斑马鱼对RXRA的研究方式可以应用于更多后续发现的AIC修饰基因，在寻找新治疗靶点的同时为其在临床上的准确，或者说正确，应用提供思路。”

本文的通讯作者徐晓雷教授也向我们介绍：“斑马鱼作为一种高通量的遗传学模式生物，可以很好的服务于心血管疾病的个体化医疗研究。我们将把这里提到的正向遗传学筛选平台与人类全基因组关联研究（GWAS）手段相结合，系统筛查AIC修饰基因，发展相关疗法，并将类似的方法应用与其他心血管疾病的基因研究中。”

本文的合作单位包括加州大学洛杉矶分校（UCLA），长沙湘雅二院，北京安贞医院和北京中医药大学。

原文链接：

https://advances.sciencemag.org/content/advances/6/5/eaay2939.full.pdf

参考文献