Cell :增强肿瘤免疫治疗的新策略：抑制细胞内吞学术资讯

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撰文 | 胡小话
抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxic, ADCC) ，简而言之，就是具有杀伤性的细胞 (如NK细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞等) 通过其表达的Fc受体识别包被于靶抗原上的抗体Fc段，直接杀死靶细胞。基于这一思路，科学家们研制出了识别不同分子靶点的单抗，从而诱导细胞毒免疫效应细胞去清除病毒感染的细胞以及肿瘤细胞等。其中比较有代表性的单抗包括Cetuximab (Anti-EGFR IgG1) ，Trastuzumab (Anti-HER2 IgG1) 和Avelumab (Anti-PD-L1 IgG1) 。这里值得一提的是，Avelumab尽管通过抑制PD1-PDL1相互作用从而激活T细胞功能而受到普遍关注，但是它也可以通过激活ADCC来发挥抗肿瘤作用【1】。

事实上，尽管这些单抗在临床上取得了一定的成效，但是仍然有少部分类型的肿瘤并不响应这一治疗手段，此外，即使有响应的肿瘤往往在接受治疗之后也很容易出现抵抗并导致肿瘤的复发。那么肿瘤为什么会产生抵抗呢？越来越多的证据显示，肿瘤的免疫疗法失效可能与内吞作用 (endocytosis) 相关，如有研究表明：内吞作用介导的EGFR内化 (internalization) 是导致Cetuximab治疗失败的直接原因，且与鳞状细胞癌 (SCC) 的进程存在100%的相关性【2】。

基于这些发现，科学家们提出这样一个科学问题：适当的抑制内吞作用是否可以增敏肿瘤的免疫治疗效果？
2020年3月5日，来自澳大利亚昆士兰大学迪亚曼蒂纳学院的 Fiona Simpson 教授与其合作者们在Cell上发表了题为Endocytosis Inhibition in Humans to Improve Responses to ADCC-Mediating Antibodies的研究，发现抑制细胞内吞作用可以有效增强单抗对于肿瘤的治疗效果，此外他们的研究证实其中一种抑制内吞作用的小分子抑制剂——prochlorperazine (PCZ) ，具有很好的临床应用前景。

作者首先考察了当用Dyngo4a (动力蛋白dynamin的抑制剂) 抑制内吞作用后，Cetuximab对鳞状细胞癌(SCC)的治疗效果。免疫荧光结果表明，无论是对Cetuximab敏感（EGFR细胞膜高表达）的A431细胞，还是Cetuximab不敏感（EGFR细胞膜低表达）的KJD细胞中，Dynogo4a处理都能显著增加Cetuximab与EGFR在细胞膜上的结合，并且能进一步提升单核巨噬细胞 (PBCMs) 对于肿瘤的杀伤作用。

那么作者接下来想搞清楚的问题是：是否单纯的增加细胞膜上的EGFR表达量就可以提升Cetuximab诱导的ADCC响应？为了验证这一猜想，作者选用了另外一种阻碍EGFR内化的抑制剂—Pistop2（可以抑制批网格蛋白小泡，CCV）来进行试验。结果表明:尽管Pistop2处理也能增加膜上EGFR的蛋白量，但是却不能提升Cetuximab的效果。借助结构光照明超分辨显微镜(3D-SIM)，作者发现当用Pistop2处理之后，细胞膜上的EGF是分散分布的，而用Dyngo4a处理之后EGF主要在CCV中富集，但是由于无法被运输到细胞当中从而在细胞膜上聚集。这说明仅仅提高细胞膜上单抗识别的分子靶标蛋白的表达量是不够的，只有它们聚集在一起才能够触发ADCC响应。

为了排除前面观察到的实验现象是由dynamin抑制剂的非特异性所致，作者又考察了HER2内吞作用对Trastuzumab治疗效果的影响。HER2内吞作用比较复杂，可以分为网格蛋白依赖、网格蛋白非依赖以及快速内皮素介导的细胞内吞作用 (FEME) 三种途径，作者发现Dyngo4a对于提升Trastuzumab治疗效果同样适用。紧接着，为了进一步排除dynamin抑制剂的脱靶效应抑或是通过影响免疫细胞来发挥功能，作者在SCC肿瘤细胞中转染了dynamin酶活缺失的K44A突变体，发现同样可以增强Cetuximab诱导的ADCC响应。此外，考虑到Dyngo4a的使用不能被临床通过，作者试验了另外一种dynamin抑制剂—酚噻嗪家族的PCZ，同时也被用作抗精神病药物【3】，因而具有更良好的临床应用前景。作者发现PCZ也可以增强Cetuximab的治疗效果。

此外，作者还探究dynamin抑制剂对于另外两种分子靶标内化机制未知的单抗治疗效果的影响，Lumretuzumab (Anti-ErbB3 IgG1) 和 Dalotuzumab (Anti-IGF-1R IgG1)，结果发现Dyngo4a和PCZ并不能抑制ErbB3和IGF-1R的内吞作用，因此无法提升这两种单抗诱导的ADCC响应，这说明，在用单抗治疗肿瘤时，提升肿瘤细胞ADCC响应是抑制内吞作用所特异的。此外，作者通过检测相关膜受体蛋白的下游信号通路的激活排除了单抗与dynamin抑制剂联用是通过反向调控信号通路的激活发挥功能的。
接下来，为了进一步验证了PCZ可以在体内发挥治疗肿瘤的效果，作者在小鼠移植瘤模型中对之前的结果进行了验证。在NSG荷瘤小鼠中，Cetuximab和PCZ联用可以显著抑制肿瘤的生长和转移。在BALB/c荷瘤小鼠模型中，PCZ除了通过抑制PD-L1的内化增敏Avelumab的治疗效果之外，还可以增强免疫细胞的记忆能力，从而大大降低肿瘤的复发。
最后，考虑到PCZ对于肿瘤的免疫治疗具有如此良好的疗效，作者开展了一项探索性临床试验 (pilot clinical study)。借助EGF-Alexda488荧光标记物，作者发现PCZ给药之后，实验组所有癌症患者的肿瘤组织上EGF结合显著增加，而对照组EGF信号则具有较强的异质性。同时作者提到，之所以选用EGF-Alexda488而不是用EGFR的抗体直接检测，是考虑到膜上有很少的EGFR就可以被抗体识别，而只有当膜上的EGFR聚集在一起的时候才能检测到EGF的信号。
小结一下：其实PCZ，作为一种胞吞作用的抑制剂，已经被广泛用于临床，如治疗病毒感染【4】，真菌感染【5】，癫痫【3】，慢性肾病【6】，甚至被拿来用于治疗癌症【2,7】。但关于肿瘤治疗的概念却始终没有转化成临床，因此，Fiona Simpson 教授首次在活体内证实PCZ的确可以抑制EGFR的内化过程，这为今后的临床试验提供了强有力的证据支持。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.019

参考文献

1. Imai, K., and Takaoka, A. (2006). Comparing antibody and small-molecule therapies for cancer. Nat. Rev. Cancer 6, 714–727.2.Joseph, S.R., Gaffney, D.C., Barry, R., Hu, L., Banushi, B., Wells, J.W., Lambie, D., Strutton, G., Porceddu, S.V., Burmeister, B., et al. (2019). An Ex Vivo Human Tumor Assay Shows Distinct Patterns of EGFR Trafficking in Squamous Cell Carcinoma Correlating to Therapeutic Outcomes. J. Invest. Dermatol. 139, 213–223.3. Li, Y.Y., Chen, X.N., Fan, X.X., Zhang, Y.J., Gu, J., Fu, X.W., Wang, Z.H., Wang, X.F., and Xiao, Z. (2015). Upregulated dynamin 1 in an acute seizure model and in epileptic patients. Synapse 69, 67–77.4. Carro, A.C., Piccini, L.E., and Damonte, E.B. (2018). Blockade of dengue virus entry into myeloid cells by endocytic inhibitors in the presence or absence of antibodies. PLoS Negl. Trop. Dis. 12, e0006685.5. Bar-Yosef, H., Vivanco Gonzalez, N., Ben-Aroya, S., Kron, S.J., and Kornitzer,D. (2017). Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Sci. Rep. 7, 5692.6. Schiffer, M., Teng, B., Gu, C., Shchedrina, V.A., Kasaikina, M., Pham, V.A., Hanke, N., Rong, S., Gueler, F., Schroder, P., et al. (2015). Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nat. Med. 21,601–609.7. Mellman, I., and Yarden, Y. (2013). Endocytosis and cancer. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a016949.

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