李伟/张映合作团队开发新型遗传筛选系统学术资讯

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正向遗传学筛选技术是目前研究表型和基因之间关系的重要手段。随着高通量测序技术的发展，正向遗传学筛选技术被越来越多地应用于复杂生命过程的研究。传统的正向遗传学筛选常采用物理或化学诱变法，即实验对象经过射线照射或化学诱变剂处理后构建突变库，然后从突变库中筛选出具有特定表型的突变体，最后鉴定这些突变体在基因组上发生了哪些变化，从而建立起基因与表型之间的关系。近些年，基于可编程核酸内切酶（例如CRISPR-Cas9）技术，人们构建了一套集成文库设计与合成、载体构建与转染、变体筛选与鉴定的实验流程，用来研究表型与基因型之间的关系。尽管这套实验方案能够高效准确地筛选出调控相关表型的基因，但是在操作过程中具有成本高、费时费力等缺点。

2020年3月20日，中国科学院动物研究所李伟研究员和张映副研究员合作团队（博士生毛俊杰、许凯、韩稼葆为共同第一作者）在Protein & Cell杂志上发表文章 Rapid construction of a whole-genome mutant library by combining haploid stem cells and inducible self-inactivating PiggyBac transposon ，构建了“One-Shot” 筛选系统。

在这项研究中，研究人员结合了转座子技术和单倍体干细胞技术，将包含诱导自失活PiggyBac基因捕获元件（induced self-inactivating PiggyBac gene trapping element）的slingshot筛选系统定点整合到单倍体干细胞的mRosa26位点中，构建了“一”个细胞只包“一”含个捕获元件、每次诱导转座只发生“一”次基因捕获的单靶点筛选系统，命名为“One-Shot” 筛选系统。由于“One-Shot”筛选系统将筛选元件定点整合到了基因组中，且该筛选元件为4-Hydroxytamoxifen （4-OHT）诱导的转座系统，所以“One-Shot“系统在诱导之前是均质的，能够冻存和扩增。在筛选之前，只需要用流式细胞分选技术富集”One-Shot“中的单倍体，经过细胞扩增，加入4-OHT诱导3天后，即可获得突变体库，从而省略了文库合成、载体构建、细胞转染等步骤。除此之外，“One-Shot”系统避免了转染过程中一个细胞进入多个筛选元件的弊端，从而降低了筛选过程中的假阳性率。运用“One-Shot“系统，研究人员进行了干细胞多能性相关基因以及嘌呤霉素（puromycin）抗性基因的筛选。

通过对筛选得到的基因进行功能验证，证实“One-Shot”系统是一个方便、高效的高通量正向遗传学筛选工具。未来结合单倍体胚胎干细胞分化成单倍体体细胞的能力，这个系统也能够转移到体细胞上进行遗传筛选。同时，如果用其他元件（例如CTCF binding site）替代”One-Shot“系统中的trapping元件，也有望进行非loss-of-function的其它类型的遗传筛选。

图注：One-Shot筛选系统

原文链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-020-00702-0

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