热转变蛋白质谱分析技术分析组织以及全血药物靶标学术资讯

来源：BioArt

撰文 | 十一月

鉴定药物-靶点之间的相互作用可以使用细胞热转变分析（Cellular thermal-shiftassay , CETSA）技术，该技术在一些简单的细胞系统中体系建立的比较完善，但是在体内的应用还充满挑战。

近日，德国海德堡葛兰素史克公司Marcus Bantscheff以及 Giovanna Bergamini研究团队与德国EMBL Mikhail M. Savitski研究组合作在Nature Biotechnology杂志上发表了文章Identifying drug targets in tissues and whole blood with thermal-shift profiling，使用热转变分析鉴定组织以及全血中药物的靶标，利用热转变蛋白质谱分析技术帮助阐明药物在生物体内发挥作用的机制。

作者们建立的方法称为组织热蛋白质组分析（Tissue thermal proteome profiling , tissue-TPP)，TPP技术本身是通过测量在加热细胞和裂解物到一定温度范围后的蛋白质的可溶性部分来确定整个蛋白质组的热稳定性，通过将定量质谱法【1】与细胞热转变分析【2-4】结合使用，对蛋白-蛋白相互作用进行全蛋白质组的评估。细胞热转变分析方法最近被应用于组织中对体内给药后单个药物靶点的热稳定性变化的检测【5】,然而在体内评价蛋白质组的热稳定性和化合物选择性分析的策略仍然缺乏。

但从体外系统到体内研究的靶向效应和脱靶效应对于预测疗效以及对预测不良反应至关重要。在验证组织粗提物能够很好地对应体内的结果后，作者们使用大鼠的组织切片粗提物作为药物检测的样品来源。作者们对大鼠体内的不同组织进行切片、热处理以及机械组织破坏后对样品极性定量质谱分析（图1）。对对照组的实验大鼠组织分析后发现，尽管不同的组织中结构和密度不同，但是热处理之后蛋白质组的分析结果一致性较高，说明组织热蛋白质组分析在不同的组织中有着广泛应用的可能性。

图1组织热蛋白质组分析在体内的应用流程图

对热处理之后的不同组织的热蛋白质谱进行对比和GO分析后作者们发现，相较于肺脏和脾脏，在肝脏和肾脏中脂肪酸β-氧化和细胞修饰氨基酸代谢过程相关的蛋白质热转变蛋白质谱中表现出了更高的热稳定性和高表达量。这些结果说明肝脏细胞和肾脏中的细胞具有更高的脂肪酸氧化能力，也说明了肾脏和肝脏在生物合成以及器官内氨基酸交换的重要功能【6】。

一个蛋白的热稳定性改变有几个可能的解释：蛋白质的翻译后修饰以及蛋白-蛋白之间的相互作用【7,8】。但目前为止并没有体内的结果显示蛋白质的热稳定性是否存在相应的变化。为此，作者们对于热处理之后的组织中Stat家族的蛋白进行分析后发现，在肝脏中比其他器官相比Stat家族的蛋白具有明显较低的熔点。而且在肝细胞中已有报道显示Stat信号通路受到酪氨酸磷酸化的调控并在细胞增殖中发挥作用【9】，因此，作者们推断蛋白质热稳定性的结果一定程度上说明了磷酸化修饰状态的不同可能会对组织中蛋白质的热稳定性具有一定的影响。

通过对于不同组织中的蛋白质复合物进行分析后发现组织热转变蛋白质谱分析同样用以反映不同组织中相同复合物中组分的相互作用。随后作者们对于大鼠施用了组蛋白去乙酰化酶抑制剂，希望通过组织热转变蛋白质谱分析对于大鼠体内的不同组织对于该抑制剂的响应进行检测。

总的来说，该技术能够发现药物在组织粗提物中靶点与脱靶现象，并且能帮助发现新的相互作用的蛋白。相较于组织粗提物来说，对于人体的检验全血检测是更容易也对人体更加有好的方式。因此，进一步地，作者们在全血样品中进行了组织热转变蛋白质谱分析。该技术应用于全血的检测优点在于在热处理之前不引入任何额外的稀释步骤，从而能够进行药理学相关的靶标结合测量。除了已知的一些响应HDAC抑制剂的因子之外，还检测到了一些新的蛋白质相互作用的变化。

总的来说，作者们建立了在体内利用组织粗提物进行热转变蛋白质谱分析的方法检验药物靶点以及是否存在脱靶效应，该方法同样可以验证体内蛋白质的翻译后修饰以及蛋白-蛋白相互作用的变化。相较于组织活检，对于全血样品的热转变蛋白质谱分析方法的应用，更是极大地推动了该技术在临床方面的使用潜能。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-019-0388-4

参考文献

1. Bantscheff,M., Lemeer, S., Savitski, M. M. & Kuster, B. Quantitative mass spectrometryin proteomics: critical review update from 2007 to the present. Analytical and bioanalytical chemistry 404, 939-965,doi:10.1007/s00216-012-6203-4 (2012).2. MartinezMolina, D. et al. Monitoring drugtarget engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science 341, 84-87, doi:10.1126/science.1233606 (2013).3. Savitski,M. M. et al. Tracking cancer drugs inliving cells by thermal profiling of the proteome. Science 346, 1255784,doi:10.1126/science.1255784 (2014).4. Savitski,M. M. et al. Multiplexed ProteomeDynamics Profiling Reveals Mechanisms Controlling Protein Homeostasis. Cell 173, 260-274 e225, doi:10.1016/j.cell.2018.02.030 (2018).5. Ishii,T. et al. CETSA quantitativelyverifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in variousbiospecimens. Scientific reports 7, 13000,doi:10.1038/s41598-017-12513-1 (2017).6. vande Poll, M. C., Soeters, P. B., Deutz, N. E., Fearon, K. C. & Dejong, C. H.Renal metabolism of amino acids: its role in interorgan amino acid exchange. Am J Clin Nutr 79, 185-197, doi:10.1093/ajcn/79.2.185 (2004).7. Reinhard,F. B. et al. Thermal proteomeprofiling monitors ligand interactions with cellular membrane proteins. Nat Methods 12, 1129-1131, doi:10.1038/nmeth.3652 (2015).8. Tan,C. S. H. et al. Thermal proximitycoaggregation for system-wide profiling of protein complex dynamics in cells. Science 359, 1170-1177, doi:10.1126/science.aan0346 (2018).9. Gao,B., Wang, H., Lafdil, F. & Feng, D. STAT proteins - key regulators ofanti-viral responses, inflammation, and tumorigenesis in the liver. J Hepatol 57, 430-441, doi:10.1016/j.jhep.2012.01.029 (2012).

来源：BioGossip BioArt

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA3MzQyNjY1MQ==&mid=2652482750&idx=5&sn=d30c287b32b20c0bc179534df156f36a&chksm=84e23f0ab395b61c07e7c503661674e88f1f182d54a05f80791f8b71a6d6211eb4a8260b092d#rd

电话：（010）86409582

邮箱：kejie@scimall.org.cn