Cas9蛋白本身可激活p53通路并促进p53失活型突变的择性富集

来源：BioArt

撰文 | 木兰之枻

责编 | 兮

CRISPR-Cas9系统的出现为基因组编辑和基因表达调控研究带来了革命性的变化。其基因组编辑的基本原理是，Cas9蛋白在特定sgRNA的引导下，切割目标位点引入DNA双链断裂（DSBs），之后经由非同源重组修复（NHEJ）或同源重组修复（HDR）途径实现目标基因的编辑。考虑到CRISPR-Cas9系统的便捷和高效，其在基础研究和临床应用的使用日益广泛。不过，作为外源系统，其潜在的安全风险也广受关注。2018年，有研究者指出，CRISPR-Cas9系统能激活p53而引发DNA损伤，而活化的p53则会抑制CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率（详见BioArt报道：两篇Nat Med致CRISPR股票大跌，这回是因为p53）【1,2】；之后研究者还发现，CRISPR-Cas9还会在DSBs位点停留而导致大片段缺失乃至各种复杂的染色体结构异常（详见BioArt报道：NBT丨CRISPR编辑技术面临新的安全隐患——胡家志点评）【3】。以上研究关注的是Cas9蛋白与sgRNA同时存在时的安全风险，考虑到Cas9蛋白是一种外源性的核酸酶，其单独过表达对细胞和动植物等研究体系的影响值得进一步评估。2020年，研究者在人胚胎干细胞中发现，Cas9蛋白能直接结合DNA-PK复合物而干扰DNA修复通路（详见BioArt报道：特别关注丨 CRISPR-Cas9系统的新风险——破坏DNA-PK依赖的修复通路引发DNA损伤）【4】，这提示我们， Cas9蛋白本身便有潜在的安全风险。

2020年5月19日，来自Broad研究所和以色列特拉维夫大学的Uri Ben-David实验室在Nature Genetics杂志上发表了题为Cas9 activates the p53 pathway and selects for p53-inactivating mutations的论文。文章对Cas9蛋白本身的安全风险做了进一步评估。研究指出，在没有外源sgRNAs的条件下，Cas9蛋白过表达可激活多种细胞系中的p53通路并促进p53失活型突变的选择性富集。研究还发现，与p53失活的细胞系相比，Cas9在p53正常的细胞系中活性偏低；此外Cas9介导的p53活化会改变细胞对遗传/化学筛选的敏感性，从而影响筛选结果。

为系统性评估Cas9蛋白过表达的安全风险，研究者通过慢病毒感染的策略构建出165种Cas9过表达的稳转细胞系并对其基因表达谱进行分析。结果显示，与对照组相比，平均有87种基因的表达在Cas9细胞系中发生明显改变（表1）。基因富集分析（GSEA）指出，25种细胞系中Cas9过表达会显著激活p53通路及NF-κB通路，且这种对p53通路的激活主要发生于p53基因正常的细胞系中（TP53-WT细胞系）。之后研究者采用蛋白免疫印迹（western blot）法对Cas9过表达后p53及其下游靶基因p21的表达水平进行检测，结果表明，在五种TP53-WT细胞系中进行的八次实验中，七次实验均显示Cas9过表达会上调p53或p21蛋白的表达；而在四种p53失活型细胞系的四次实验中，Cas9过表达对p53或p21蛋白的表达无明显影响（表1）。此外，实时定量PCR实验进一步证实，TP53-WT细胞系中Cas9过表达会促进多种p53下游靶基因的表达。之后，研究者进一步排除了慢病毒感染、实验操作及筛选的瓶颈效应等可能导致p53通路活化的因素，从而证实了Cas9蛋白过表达是细胞系中p53通路活化的关键。

表1 Cas9过表达对各细胞系的影响

已知p53和NF-κB通路是DNA损伤转录响应的主要调控因子，这提示Cas9介导的p53活化或与DNA损伤有关。GSEA分析发现， 32/165种细胞系中Cas9过表达会导致DNA修复转录特征基因的显著富集；免疫荧光染色也证实，Cas9过表达会增加DNA双链断裂的风险。由此研究者推测，Cas9过表达导致DNA损伤风险增加或是p53通路活化的重要诱因，而p53活化很可能会限制细胞中Cas9蛋白的表达。因此，细胞要稳定表达Cas9很可能会导致p53失活型突变的选择性富集。为验证以上猜想，研究者对42种细胞系中447种癌基因的点突变特征进行系统分析后发现， Cas9过表达细胞系更易富集新的非同义突变。与相应的对照组相比，Cas9过表达细胞系平均富集4.5个癌基因相关的非沉默突变，这其中TP53基因在易突变癌基因中位居前列（前4%）。42种检测过的细胞系中，Cas9过表达导致细胞系JHH7中出现纯合的TP53非沉默突变，细胞系SNU1中出现TP53失活型突变；并导致另两种细胞系293T和HCC1419中携TP53失活型突变的亚克隆在增殖中占据明显优势从而呈现出选择性富集；此外，还有八种细胞系中的十种携TP53失活型突变的亚克隆在Cas9过表达后呈现出选择性富集。与此相对的是，三种对照组细胞系（空白对照组、报告基因或DNA条形码慢病毒感染组）中，并未有任何TP53非沉默突变的出现或选择性富集。研究者还发现，与其它抑癌基因相比，TP53非沉默突变亚克隆的选择性富集最为明显。HCT116细胞系中的细胞竞争实验也证实，Cas9过表达可特异性的促进携有TP53失活型突变细胞的增殖优势。此外研究者发现，TP53-WT细胞系中Cas9的活性明显低于其在TP53突变型细胞系中的活性。综上可知，p53确会限制Cas9的有效表达及活性，与之相对的是，Cas9过表达则促进p53失活型突变的选择性富集以保障自身的活性。

Cas9过表达对p53通路的激活会否影响并干扰CRISPR-Cas9为基础的筛选结果？研究者发现，与TP53突变型细胞系相比，TP53-WT细胞系中CRISPR-Cas9筛选结果与RNAi筛选结果的重合率明显降低。功能富集分析也发现，仅见于CRISPR-Cas9筛选结果的目的基因明显富集DNA复制与DNA损失修复以及RNA加工与病毒转录两大通路。研究者还指出，与其它细胞系相比，p53通路可被Cas9激活的细胞系中，CRISPR-Cas9介导的TP53基因敲除能更明显的促进细胞增殖。研究还发现，MCF7细胞系中，Cas9过表达能增加细胞对MDM2抑制剂的敏感性。这一系列结果均表明，细胞系中Cas9诱导的p53活化很可能会对遗传筛选和化学筛选的结果产生干扰。

总体而言，该研究通过一系列实验证实，在多种细胞系中Cas9蛋白本身可通过诱导DNA损伤而激活p53通路，并导致10%的细胞系中出现p53失活型突变的选择性富集。该研究提醒我们，在TP53-WT细胞系中过表达Cas9时须仔细监测p53的状态，且在应用CRISPR-Cas9技术时须对研究结果多加审视。目前我们对CRISPR-Cas9系统的安全风险及相关机制的认识仍有不足，因此需要更多研究为CRISPR-Cas9系统的未来应用奠定基础。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41588-020-0623-4

参考文献