中药牛蒡子主要活性成分微生物转化研究进展

来源：药学进展

专家介绍：王秀伶

博士，教授，博导。河北农业大学微生物学科带头人，制药工程专业负责人，中国微 生物学会医学微生物学与免疫学专业委员会委员，河北省微生物学会常务理事，河北省研究生教育指导委员 会理学分委员会委员。2010年入选第二批河北省高校百名优秀创新人才支持计划，2015年荣获“全国师德标 兵”荣誉称号。 主要研究方向：1）微生物药物转化；2）益生菌资源挖掘与利用。主持国家自然科学基金面上项目 5 项，河北省应用基础研究计划重点基础研究项目1项。以第一作者或通讯作者在 Applied and Environmental Microbiology、 Journal of Agricultural and Food Chemistry、 Applied Microbiology and Biotechnology 等国内外期 刊发表论文50余篇，其中 SCI 收录13篇；以第一专利发明人获国家授权发明专利 15 项。

正文

中药牛蒡子主要活性成分微生物转化研究进展

[摘要]牛蒡子为菊科草本植物牛蒡的干燥成熟果实，具有抗炎、抗病毒、抗糖尿病等多种药理功能。目前已知，牛蒡苷和牛蒡苷元是中药牛蒡子的主要活性成分，摄入体内的牛蒡苷或牛蒡苷元可进一步被肠道菌群转化为去甲基牛蒡苷元、肠二醇、肠内酯等多种代谢产物。现有研究表明，牛蒡苷或牛蒡苷元的微生物转化产物具有比牛蒡苷元更高、更广的生物学活性。综述不同产地牛蒡子主要活性成分含量、药代动力学及肠道菌群代谢差异，旨在为牛蒡子主要活性成分微生物转化产物的研究与开发提供参考。

菊科草本植物牛蒡（Arctium lappa L.）具有药食同源性。牛蒡根常作菜用或制作牛蒡茶，具有清热解毒、利尿通便等功效；牛蒡子是牛蒡的干燥成熟果实，具有疏风散热、解毒透疹、利咽消肿等功效。牛蒡子为我国传统中药，目前报道的牛蒡子的主要生物学活性包括抗炎、抗癌、抗糖尿病、降血脂、抑菌、抗病毒、止咳、治疗便秘、免疫活性、抗氧化、抗疲劳、抗肾病、抗老年痴呆、抗过敏、护肝、抑制K+挛缩等。临床上，牛蒡子复方制剂可治疗咽炎等上呼吸道炎症、咳嗽和哮喘等肺部不适以及流感病毒引起的多种疾病。

1牛蒡子主要活性成分

陈思有等研究显示，牛蒡子含有木脂素类、挥发油和油脂类成分，其中木脂素类化合物牛蒡苷（arctiin）和牛蒡苷元（arctigenin）是牛蒡子的主要有效成分。此外，马天宇等研究显示，牛蒡子中还含有少量的生物碱、维生素、氨基酸及蛋白质等。目前已知，牛蒡苷是中药牛蒡子的标志性成分，牛蒡苷的含量为5.3%~7.3%，平均为6.7%；牛蒡苷元的含量为0.5%~1.5%，平均为0.55%。2015年版《中华人民共和国药典》规定，牛蒡子中牛蒡苷含量不得低于5%。然而，不同产地牛蒡子中的牛蒡苷含量相差较大（见表1）。

从目前已有文献来看，高效液相色谱法是牛蒡苷及牛蒡苷元最主要的检测方法。米靖宇等对产自黑龙江（哈尔滨）、辽宁（沈阳）、河南（郑州）、山东（青岛）、江苏（南京、苏州）、北京、天津、内蒙古（呼和浩特）、四川（成都）、云南（昆明）、新疆（石河子）、青海（克拉玛依）等地的牛蒡子中的牛蒡苷进行含量测定，结果显示，牛蒡子样品中的牛蒡苷含量以产地昆明最高（8.02%），产地郑州的最低（4.07%），其余产地牛蒡苷含量均介于5.47%~7.07%之间。邵晶等对吉林、四川（康定）、河南、甘肃（定西、临洮、平凉、和政、庆阳、甘南）等地的牛蒡子样品中的牛蒡苷含量进行测定，结果显示，除平凉牛蒡子中的牛蒡苷含量较低外（3.96%），其余产地牛蒡苷含量在5.86%~7.95%之间。王劲对黑龙江（哈尔滨）、长春、辽宁（灯塔、葫芦岛）、山东（青岛）、广东（广州）、四川（成都、阿坝、简阳）、贵州和新疆等地的牛蒡子样品中的牛蒡苷含量进行测定，结果显示，这些产地的样品中牛蒡苷含量均在8%以上。另外，陈思有等对黑龙江（五常）、吉林（梅河口、辽源、通化、延吉）、辽宁（岫岩、宽甸）、内蒙古（山民）、重庆、陕西（太白）、甘肃（会川）等不同产地牛蒡子中的牛蒡苷和牛蒡苷元进行含量测定，结果显示，所有样品中牛蒡苷含量均在13%以上。根据杨亮蕊等对云南昭通锦屏村、次山乡、昭阳区、大理银桥等4个地区牛蒡子样品中牛蒡苷和牛蒡苷元的测定显示，牛蒡苷的含量极低（0.0691%~0.1535%）。目前，有关影响牛蒡子中牛蒡苷含量的因素尚不清楚。

2牛蒡苷和牛蒡苷元药代动力学研究

吕佳对牛蒡苷元在小鼠胃肠道吸收动力学、家兔体内的血浆药物动力学以及大鼠脏器分布状况等进行了研究。其中，小鼠胃肠道吸收实验结果显示，牛蒡苷元在胃肠道内较为稳定；另外，家兔静脉注射的牛蒡苷元浓度不同，牛蒡苷元在体内的消除动力学也各不相同，静脉注射低浓度（610mg·kg-1）时，牛蒡苷元的消除符合线性动力学模型，而静脉注射浓度较高时，牛蒡苷元在家兔体内消除较快；给大鼠灌胃牛蒡苷元24h后检测发现，约0.423%的牛蒡苷元从大鼠尿液中排出，0.11%从粪中排出；组织分布实验结果显示，牛蒡苷元广泛分布在肝、肺、心、脾、肾等组织中，其中在肝、肺中的含量较高，但在脑组织中未检测到牛蒡苷元。郑一敏等用300mg·kg-1牛蒡苷灌胃大鼠后发现，其药物动力学行为符合二室模型，血浆内检测到牛蒡苷是在经口给药5min后，消除现象发生在30min后；牛蒡苷在大鼠肝脏中分布最多，并在心、肾及脑部组织均有分布。类似地，胥秀英等研究结果显示，给小鼠灌胃牛蒡子后，牛蒡苷在不同组织分布浓度由高到低顺序为肝、肾、心、脑。韩舒等研究显示，给大鼠皮下注射牛蒡苷元（0.3mg·kg-1）后，在肠、心、肝、胰、肾等组织中均检测到原形药物。何斌等对牛蒡苷元在仔猪体内的药代动力学研究结果显示，牛蒡苷元静脉注射后血药浓度与时间符合无吸收二室模型，这不同于吕佳报道的家兔静注牛蒡苷元后其药代动力学行为属无吸收单室模型。袁媛对牛蒡子水提物的药代动力学研究结果显示，给大鼠灌胃牛蒡子水提物后，在大鼠的尿液和粪便中均检测到了不同于牛蒡苷元的其他成分。此外，窦德强研究结果显示，胃肠道是牛蒡苷的主要代谢器官，而肝没有参与代谢。

3牛蒡苷和牛蒡苷元微生物转化研究

3.1哺乳动物粪样菌群对牛蒡苷的转化

现有研究结果表明，被哺乳动物摄入体内的牛蒡苷（1）可被脱糖转化为牛蒡苷元（2），这是牛蒡苷在机体内发生的第一步代谢反应。Nose等将底物牛蒡苷与小鼠粪样菌群共培养24h后，在培养物中检测到了大量牛蒡苷元，表明大部分底物牛蒡苷的4'位葡萄糖基已被脱掉。Wang等研究结果再次证实，小鼠粪样菌群对牛蒡苷具有脱糖转化作用。除小鼠粪样菌群外，将人粪样菌群与牛蒡苷共培养后发现，人粪样菌群同样可以将底物牛蒡苷转化为牛蒡苷元。

除上述脱糖转化外，Nose等还发现小鼠粪样菌群对脱糖转化产物牛蒡苷元具有进一步转化能力，经结构鉴定发现，小鼠粪样菌群能将底物牛蒡苷元3'位甲基脱去，生成3'-去甲基-牛蒡苷元（3'-desmethylarctigenin，3'-DMAG，3）；由于3'-DMAG为非天然产物，推测小鼠粪样菌群分泌的相关酶类将底物牛蒡苷元脱甲基转化为3'-DMAG。Wang等研究结果显示，除牛蒡苷元和3'-DMAG外，小鼠粪样菌群转化底物牛蒡苷后的代谢产物还包括3'-去甲基-4'-去羟基牛蒡苷元（4）等。除小鼠粪样菌群外，Heinonen等于2001年首次证实，人粪样菌群能将底物牛蒡苷转化为多种不同代谢产物，经产物分离鉴定发现，底物牛蒡苷可被人粪样菌群转化为牛蒡苷元以及牛蒡苷元去甲基和去羟基产物。2003年Xie等从牛蒡苷与人粪样菌群共培养物中分离得到6种牛蒡苷的不同代谢产物，即牛蒡苷元、3'-DMAG、3'-去甲基-4'-去羟基牛蒡苷元、3'，3''-去甲基-4'-去羟基牛蒡苷元（5）、3'，3''，4''-去甲基-4'-去羟基牛蒡苷元（6）和肠内酯（enterolactone，7）；此外，根据代谢产物的化学结构，推测了牛蒡苷被人肠道菌群代谢的过程（见图1）。

3.2牛蒡苷或牛蒡苷元转化菌株的分离与筛选

2007年Jin等将人粪样菌群与底物牛蒡苷元共培养，首次分离得到一株对牛蒡苷元有转化功能的微生物纯培养物，经菌种鉴定，将分离得到的纯培养物鉴定为厌氧真细菌属的一个新分类单元，即菌株Eubacteriumsp.ARC-2。研究结果显示，在厌氧环境下与底物牛蒡苷元共培养62h后，菌株ARC-2能将底物牛蒡苷元转化为二羟基肠内酯（dihydroxyenterolactone）、3'-O-甲基醚二羟基肠内酯（dihydroxyenterolactone3'-O-methylether）、3''-O-甲基醚二羟基肠内酯（dihydroxyenterolactone3''-O-methylether）、4''-O-甲基醚二羟基肠内酯（dihydroxyenterolactone4''-O-methylether）、4''-去甲基牛蒡苷元（4''-desmethylarctigenin）、3'-DMAG以及3''-去甲基牛蒡苷元（3''-desmethylarctigenin）等7种不同代谢产物。仅从高效液相色谱图所示代谢产物峰的峰面积来看，3''-去甲基牛蒡苷元和4''-O-甲基醚二羟基肠内酯这2种产物的峰面积较大；通过硅胶柱对产物进行分离，并对得到的各代谢产物进行量化分析显示，菌株ARC-2代谢底物牛蒡苷元后生成的二羟基肠内酯和4''-O-甲基醚二羟基肠内酯的含量最多。另外，值得一提的是菌株ARC-2代谢底物牛蒡苷元所生成的7种代谢产物中并不包括肠内酯。

2013年笔者实验室从人粪样菌群中分离得到一株能将底物牛蒡苷或牛蒡苷元高效转化为3'-DMAG的严格厌氧细菌菌株，经菌种鉴定，将分离得到的菌株鉴定为布劳特菌属（Blautia）的一个新分类单元，并将菌株命名为Blautiasp.AUH-JLD56。2017年，笔者实验室以3'-DMAG为底物，分离得到对3'-DMAG具有转化功能的单一细菌菌株Eggerthellasp.AUH-JLD49s，该菌株为严格厌氧细菌菌株；菌株AUH-JLD49s在厌氧条件下能将底物3'-DMAG转化为单一产物3'-去甲基-4'-去羟基-牛蒡苷元（3'-desmethyl-4'-dehydroxyarctigenin，DMDHAG）。

肠内酯是一种具有类似动物雌激素活性的物质，因其化学结构中含有手性碳原子，故肠内酯为手性化合物（见图1）。肠内酯在自然界中并不存在，只能由木酚素类化合物经动物肠道菌群代谢后生成。研究者已分离得到能将油料作物亚麻籽中的木酚素——开环异落叶松树脂酚二葡萄糖（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）转化为肠内酯的特定细菌菌株，然而，已分离得到的菌株代谢SDG后只生成少量肠内酯，大部分产物为肠内酯合成的前体物质肠二醇。以药食两用植物牛蒡子中的标志性成分牛蒡苷为底物，利用哺乳动物粪样菌群转化生成肠内酯虽已有报道，但将牛蒡苷转化为肠内酯的单一微生物菌株目前国内外尚鲜见报道。

4牛蒡苷元代谢产物的合成与活性研究

李馥睿等2011年报道了产物3'-DMAG的化学合成方法，但由于合成过程需添加有恶臭和强刺激性的吡啶，加之化学合成反应步骤多，所需成本相对较高，目前尚鲜见市场销售化学合成的3'-DMAG。迄今，除人工合成的肠内酯有销售外，目前图1中涉及的牛蒡苷元的其他代谢产物均鲜见销售。由于3'-DMAG及DMDH-AG等产物匮乏，有关牛蒡苷元代谢产物的活性报道目前非常有限。Jin等2013年利用菌株Eubacteriumsp.ARC-2在厌氧条件下合成牛蒡苷元的不同代谢产物，并分析牛蒡苷元以及7个代谢产物与雌激素受体ERα的亲和力。结果显示，代谢产物对ERα的亲和力大小与底物被脱去的甲基的数目有关，其中脱掉2个甲基的代谢产物对ERα的亲和力均显著高于脱掉1个甲基的代谢产物。

为进一步研究牛蒡苷元代谢产物的活性，笔者实验室通过高效液相色谱法制备了产物3'-DMAG，并对比分析了底物牛蒡苷元和产物3'-DMAG对DPPH自由基的体外清除能力。结果显示，在0.025~0.100mmol·L-1范围时，产物3'-DMAG对DPPH自由基的清除能力均显著高于底物牛蒡苷元（P<0.01），但购买的肠内酯对DPPH自由基的体外清除能力明显较弱。另外，产物3'-DMAG对人肝癌细胞株HepG2具有明显的体外抑制作用，可影响HepG2的细胞周期，并诱导线粒体内凋亡的发生；小鼠体内实验研究结果显示，产物3'-DMAG显著抑制了小鼠体内肿瘤的生长，且未表现出任何毒性。由于菌株Blautiasp.AUH-JLD56为严格厌氧细菌，制备产物3'-DMAG必须在严格厌氧环境下进行，而长期维持严格厌氧环境则需要大量资金投入。为此，笔者实验室正在对菌株AUH-JLD56进行耐氧驯化尝试，以期获得在有空气氧条件下既能生长，同时又具有转化活性的耐氧突变株。

在牛蒡苷元所有代谢产物中，只有终产物肠内酯目前可进行人工化学合成，但由于合成步骤多，且产物纯化困难，导致肠内酯目前售价较高。在肠内酯的生物合成方面，杨东辉等利用哺乳动物肠道菌群转化木酚素为肠二醇和肠内酯，哺乳动物肠道菌群经传代50次后对转化结果无明显影响，但不足之处是肠道菌群在厌氧环境中转化木酚素为肠内酯的产率较低（低于30%）。另外，转化SDG为肠内酯的单一细菌菌株虽已有报道，但已报道的菌株转化木酚素为肠内酯的能力极低，肠内酯尚不能通过已分离得到的菌株进行生物合成。目前已知，肠内酯具有调节激素平衡、抗氧化、抗癌、降低心血管发病率、减少骨质流失以及缓解脂多糖诱发性炎症等多种生理功能。肠内酯为手性化合物，分布于油料作物亚麻籽中的木酚素SDG为右旋SDG，经哺乳动物粪样菌群转化后生成的肠内酯为右旋肠内酯；牛蒡子中的牛蒡苷为左旋牛蒡苷，经哺乳动物粪样菌群转化后生成的肠内酯为左旋肠内酯。由于化合物资源匮乏，有关右旋肠内酯和左旋肠内酯在药理或生理功能上的差异目前尚不清楚。

5结语

人体肠道内寄居着种类繁多、数量庞大的微生物菌群，肠道菌群能否保持平衡对维持人体健康至关重要。目前已知，日常饮食、长期压力、行为习惯以及抗生素使用等多种因素均会对肠道菌群产生影响。汤剂口服剂型为中药临床主要使用方式，中药在机体代谢的必经之路为消化道。现有研究结果显示，单一成分、单味中药和中药复方对肠道菌群均有不同程度的调节作用，且调节作用主要是通过促进有益菌生长和抑制有害菌的过度增殖来实现，有关其他方面的调节机制尚有待进一步研究。另一方面，大量研究结果证实，肠道菌群中的某些特定菌株对中药活性成分具有代谢功能，如单味中药牛蒡子，其主要活性成分经人肠道细菌菌株代谢后可生成7种不同代谢产物，由于这些代谢物具有不同于底物牛蒡苷元的生物学活性，中药本身的药效将因肠道菌群的代谢而发生改变。反过来，中药经这些微生物代谢所得产物是否又会继续影响人肠道菌群的构成或其他方面，目前尚鲜见相关报道。