高义萌/李华兵等合作揭示m6A在天然免疫和造血发育中的重要作用​

来源：BioArt

在高等哺乳动物中，RNA作为遗传物质中间载体，其精密复杂的调控机制一直是各个领域的研究热点，包括选择性剪接、转录后加工，翻译起始等。而在如此精巧的RNA上存在的化学修饰，必然有着非凡的意义。作为RNA上最普遍的内源修饰，N6-甲基腺苷（m6A）近几年随着精准测序技术的发展受到了广泛关注。前期研究利用体外细胞系以及各种动物模型和病人样本等研究工具发现m6A修饰在多种基础生物学过程以及疾病进程中都具有重要作用。那么，m6A在生理状况下对生物体的发育有何种作用，以及m6A这一RNA修饰的存在是否有一个更加普遍的生物学调控机制？这是整个研究领域长期以来一直在努力回答的问题。
在前期系统深入的研究m6A在T细胞分化（详见BioArt报道：Nature丨中美合作首次发现m6A修饰调控T细胞稳态）和功能（详见BioArt报道：李华兵组揭示m6A调控Treg细胞的抑制功能）的基础上，2020年6月3日，上海市免疫学研究所、上海交通大学医学院李华兵教授，耶鲁大学Stephanie Halene教授、Richard Flavell教授等国内外团队在Immunity杂志发表论文m6A Modification Prevents Formation of Endogenous Double-Stranded RNAs and Deleterious Innate Immune Responses during Hematopoietic Development。该论文发现RNA上m6A修饰的存在可以维持细胞对于自体RNA的自我识别作用，而m6A的缺失则会导致细胞内形成异常的内源双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA），进而引起强烈的天然免疫反应和造血系统坏死。

本研究采用了Vav-Cre; Mettl3条件性敲除小鼠，在造血系统中特异性敲除m6A的甲基转移酶（Writer）METTL3，以此来观察m6A缺失对造血系统的影响。研究人员在前期实验中很难获得Vav-Cre; Mettl3条件性敲除的小鼠个体，说明造血系统缺失m6A是胚胎致死的，难以获得成熟小鼠个体做深入研究。于是研究人员将分析时间点提前至胚胎期第14.5天（E14.5），并对E14.5的主要造血器官——胚胎肝脏进行分析。
在E14.5的时间点，各个不同基因型的小鼠胚胎的存活率符合孟德尔遗传定律，说明此时Vav-Cre; Mettl3条件性敲除的小鼠胚胎仍然存活。研究人员进而通过流式细胞术分析胚胎的造血系统发育情况，发现在Vav-Cre; Mettl3条件性敲除的胚胎肝脏中，造血干/祖细胞（Lin−Sca-1+c-Kit+，LSK细胞）有明显的积累，未能有效地分化为各个谱系的成熟血细胞。
通过RNA-seq和CUT&RUN对LSK细胞的转录组和H3K4me3组蛋白修饰的活跃转录基因进行分析，发现天然免疫和病毒响应相关的基因在Mettl3敲除的LSK细胞中相比于对照组发生明显上调，尤其是能识别病毒dsRNA并作出反应的OAS家族的基因上调明显。而H3K4me3组蛋白修饰在OAS等基因处的富集也说明OAS基因和其他免疫相关基因的上调是转录水平的上调，并不是因为m6A缺失影响转录后调控而引起的上调。
在正常状态下，细胞内的RNA都是单链的，dsRNA只有在病毒侵入细胞并进行复制的时候才会产生，这些dsRNA则会作为外源入侵RNA被天然免疫系统识别，进而引发机体强烈的免疫反应来清除病毒。为了验证在无病毒感染状态下，m6A的缺失会引起dsRNA的形成，研究者采用dsRNA特异性抗体J2，对胎肝细胞进行了免疫荧光染色和RNA免疫沉降测序实验（J2-RIP-seq）。均直接证明在m6A缺失后，细胞内会形成dsRNA，同时发现形成dsRNA的转录本都是在正常状态下有更多m6A修饰，并且长度更长、更易发生折叠的RNA。说明m6A在这些RNA上的存在可以抑制dsRNA的形成。
研究者进一步对三条经典的受dsRNA激活的天然免疫通路进行检测，发现OAS-RNase L、PKR-eIF2a和MDA5-RIG-I三条天然免疫通路在Vav-Cre; Mettl3条件性敲除的小鼠胎肝中都被激活。相应信号通路的活化又会抑制蛋白合成和细胞增殖，阻碍造血发育。而抑制相应的天然免疫通路对Mettl3条件性敲除的胎肝进行拯救实验，可以部分修复由m6A缺失所引起的造血系统坏死的表型。进一步说明m6A的缺失会导致dsRNA的形成并引起天然免疫反应和造血系统坏死。
目前，除了在胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）中敲除Mettl3可以将细胞维持在naïve状态并抑制干细胞的分化外，在其他绝大部分组织细胞中敲除Mettl3都会产生损伤性的后果，包括抑制增殖分化，影响系统发育等。这极有可能都与m6A缺失所引起的天然免疫反应有关。而由于ESCs具有免疫豁免的特性，而且其OAS相关的天然免疫基因表达量极低，故而显示出弱化的dsRNA免疫反应。这也体现出ESCs作为原始状态的干细胞相比于其他成体干细胞的显著不同。
综上所述，该研究利用条件性敲除小鼠模型为研究者认识m6A RNA修饰的功能提供了全新的视角，揭示了m6A作为天然免疫调控因子的普遍性生物学意义，并且明确了m6A在造血系统发育中的重要功能。而m6A在其他组织系统中的免疫作用和调控功能也有待于其他学者继续进行深入研究。