Neuron | 陈一茗等开发核糖体标记神经胞体成像技术学术资讯

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神经网络交错纵横，其复杂的结构以及信号传递构筑了动物行为和感官的基础。将相互连接的神经系统作为一个整体来研究，是理解其原理必不可少的一部。当下，荧光成像可以说已成为了主流的观测神经网络的方法：荧光蛋白可用来标记特定的神经组织，展示其结构；荧光探针可将生物信号比如钙离子浓度转化为光学信号，展示其动态。通过荧光蛋白，光学成像可以同时检测上百甚至上千个神经元，于此同时，将信号归纳到其中各个神经元也成了既必要也棘手的一部。造成该一步骤苦难的一个主要原因是神经细胞本身复杂的结构，每一个神经元包含了胞体 (soma) 和神经突 (neural processes) 两个部分。这一特征导致了神经元胞体常常被掩埋在其他神经的神经突之中，使得个体间难分彼此，异源的光学信号之间也因此而互相干扰。

多种方式已被提出和发展以解决该问题。比如更精密的光学仪器诸如双光子成像凭借更紧凑的点扩散函数可以大致区分胞体和周围组织间的界限。但精度的提高常常伴随着速度上的牺牲，同时细小神经组织间的干扰也并非提高成像精度便能完全解决。从计算层面上，以非负矩阵分解 (NMF) 来将神经影像拆分成个体间的总和在很大程度上消减了重叠信号之间的干扰。可是此类计算函数中的假设和不确定性会因实验条件和测量对象而异，得出的结果也通常无法直接得到考证以致造成潜在的过度补偿和人工噪音。

既然这个信号分解的问题出在神经突中荧光蛋白与胞体荧光蛋白间的干扰，那么将信号从神经突消除应该便是最直截了当的方法了。比如，利用核定位序列 (nls) 来将荧光蛋白转移到细胞核内便能让各个神经元界限分明。但由于核内钙离子信号与细胞电信号耦合不佳（测量神经元时，钙离子成像通常是用来推测电信号），该技术会使钙离子传感器GCaMP的时间精度显著降低。

2020年6月22日，UCSF的Zachary Knight组和Buck Institute的Jennifer Garrison组联手合作（第一作者为陈一茗博士）在Neuron杂志上发表了题为Soma-Targeted Imaging of Neural Circuits by Ribosome Tethering的文章，利用了核糖体的特性，展示了一种可将荧光蛋白定位在胞体内并且保留其精度的方法。

荧光蛋白的信号可由核糖标记来进行高度聚集和提升

在博士后阶段，Zack曾做了一株Nano-L10转基因小鼠。该鼠体内的核糖体亚基L10由GFP的单域抗体Nanobody所标记，通过单域抗体，GFP会通过L10聚集到核糖体上。在Knight实验室建立的初期，该技术的应用主要聚焦在提取核糖体来以及核糖体上的mRNA来对特定细胞进行深度测序(translating ribosome affinity purification, TRAP)。随着研究的进展，Knight组观察到了这些连接在核糖体的GFP总是位于神经元的胞体内，并且大概由于聚集的原因，总是使得细胞非常的明亮。逐渐大家开始用核糖体连接的荧光蛋白来分析对象细胞的分布以及数量。该文章的开头展现了这一个过程并且测试了各种不同神经组织内该方法的适用性。尤其值得关注的一点是，在过去产生的上百种标记细胞或蛋白的GFP转基因小鼠中，大多数GFP信号的微弱得若有若无的，而当这些GFP被Nano-L10聚集后，信号得到了显著的加强，使得这些转基因株能被更广泛的应用，也避免了因为信号的若有若无而误读GFP细胞本身的分布。
二
核糖标记可将GCaMP限制于胞体内
之后，作者猜想，也许这一核糖体标记(ribo-tagging)方式也适用于GCaMP以提升钙离子成像的质量。若能将所有GCaMP限制于胞体内，那将是一个对神经生物领域中光学测量手段非常有意义的提升。于是作者将GCaMP和核糖体亚基L10直接进行了连接克隆了ribo-GCaMP。经过测试，作者发现在大脑皮层(cortex)，下丘脑(hypothalamus)，海马体 (hippocampus)，上丘 (superior colliculus) 中，核糖标记都能将神经突中GCaMP大幅减弱，几近消除。通过高精度的双光子扫描成像，作者对比了核糖标记的ribo-GCaMP和普通GCaMP在神经元不同部位报告动作电位的效率。该实验发现，在胞体内，ribo-GCaMP和普通GCaMP的信号旗鼓相当。而当在测量位点离开胞体后，ribo-GCaMP的信号立即变得微乎其微，而普通GCaMP在神经元的不同部位都有大致相同的信号强度。为了进一步证实核糖标记对GCaMP的精度无损，通过高通量的场电流刺激加单光子录影。以及膜片钳加双光子成像，作者发现ribo-GCaMP和GCaMP在不同条件下都有相似的敏感度，时间精度以及信噪比。

三
Ribo-GCaMP可用于小鼠活体钙离子成像并减少信号噪音
那么，在领域内常见的光学机器下，ribo-GCaMP是否能展示出其优势呢？在小鼠内，作者以神经生物学常用的双光子成像和微型显微镜加梯度折射透滤镜(GRIN lenses)测试了ribo-GCaMP的表现。在视觉皮层内，作者惊讶地发现即便是双光子成像也遭受这严重的信号源相互污染。具体体现是，在通过GCaMP收集的数据中，当神经元之间离得越近，其信号之间的相关系数 (correlation coefficient) 就越高 - 这十分可能是因为神经元之间通过神经突造成的重叠。而当用ribo-GCaMP在相同实验条件下收集数据后，该距离与相关系数的偶联几乎尽数消失（除了50微米间距以内）。由此可见，将GCaMP从神经突消除还是对数据的质量很有提升的。而当作者用单光子的微型显微镜通过梯度折射滤镜观察内侧前额叶皮层（mPFC）时，该提升就变得非常的不显著了。作者认为这是因为在该实验条件下，主要的信号污染来自光的散射以及聚焦外光源的干扰，而将荧光限制于胞体内并无法有效改善这些光学层面上的不足。最后，作者在两个实验内发现，核糖标记会让GCaMP的亮度降低，比如双光子显微镜下需用大约2.4倍的激光强度才能达到大概一致的亮度。目前该缺陷还未得到解决的方法，原因可能是由于核糖体数量的限制，也可能是因为核糖体分布于钙离子浓度较低的部位。
活体成像非常重要的一点是所表达荧光蛋白的毒性。通过免疫染色，细胞膜特性测量，以及活体内微型显微镜 (miniscope) 三种方法观察了脑组织在表达ribo-GCaMP和普通GCaMP数周以至数月以后的变化。作者并未发现两者在细胞毒性上有任何本质上的区别。综上所述，核糖标记是一种在不改变GCaMP毒性以及活性情况下能有效将其限制在胞体内的方法。
四
Ribo-GCaMP可提升线虫全脑钙离子成像
除了小鼠外，线虫也是神经生物常用的模式生物。作者于是做了表达ribo-GCaMP的线虫来测试该技术是否可以提升线虫内的钙离子成像。由于线虫的头部微笑，一个显微视野便可以轻易地记录整个头部所有神经元的活动。在过去该成像技术依赖于带有核定定位序列的GCaMP（nls-GCaMP）来将各个神经元从错综复杂的神经网络中区分出来。若ribo-GCaMP可以在不牺牲时间精度的情况下做到相同的效果，那么将是一个很好的技术提升。经过测试，相比普通GCaMP, ribo-GCaMP可消除神经元之间信号的污染并且允许全脑，单神经元分辨率的钙离子成像。相比nls-GCaMP, ribo-GCaMP大幅提升了钙离子成像的时间精度，并且能呈现出很多会被nls-GCaMP漏过的神经活动。与小鼠内测试不同的是，ribo-GCaMP在线虫内还保留了普通GCaMP的亮度。
在这篇文章中，作者展示了一个易于使用并且能高效清除细胞突信号干扰的技术。通过将可溶的荧光蛋白间接抑或直接连接在核糖体上，作者将信号固定在了胞体内。当然，其他位点也可以用来以胞体为靶向的固定，比如钾离子通道2.1(Kv2.1)的模体(motif)，锚定蛋白 (ankyrin)，可减缓蛋白运输的模体，以及kainate受体亚基2都可将蛋白或多或少地固定于胞体周围。
回思发展和测试该技术的过程，作者认为核糖体相较之下有几个不同之处，使得其一部分特性尤其适用于固定可溶蛋白。首先，不同于膜蛋白，核糖体本身是可溶的，因此大致保证了周围是水环境以及受牵制蛋白的活性和折叠。然后，核糖体本身在关于其众多的研究中，并未发现与钙离子有重要的交互，这也许解释了为什么连接GCaMP到核糖体上并无细胞毒性。同时，作为数量最多的细胞器，核糖体能够提供大量的固定位点，保证了受牵制的蛋白可以有一定地数量来产生效果。最后，核糖体蛋白作为进化上非常悠久且重要的细胞部件，有着一套紧密的调控机制。比如，那些并未能完全整合于核糖体中的核糖蛋白会被分解。这一机制保证了单个细胞表达量的稳定，也避免了一些本该被固定的蛋白游走到细胞突内造成干扰的情况。在未来，科学家可以尝试将核糖标记运用到其他可溶蛋白上来将其固定于胞体的细胞质内。综合来看，这篇文章以及其他相同方向的努力使得生物光学成像的数据质量得到了近一步地提升。希望我们在未来可以看得更多，更精，更真实。

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