顾连峰课题组在纳米孔RNA直接测序技术检测环状RNA修饰方面取得新进展

来源：JIPB

选择性拼接是指从mRNA前体中通过不同的剪接方式产生不同的剪接异构体的过程，课题组前期研究表明选择性拼接在禾本科毛竹中是一种普遍的转录后调控现象（Wang et al.2017），通过这种方式可以产生种类多样的蛋白（Yu et al. 2019）。在拼接过程中，大量mRNA前体也可以通过反向剪接产生呈封闭环状结构的环状RNA， 产生的环状RNA可以通过R-loop结构调控线性转录本的拼接（Conn et al. 2017）。课题组前期研究成果表明环状RNA在毛竹中是广泛存在的并且在竹笋快速生长中起一定作用（Wang et al. 2019a, 2019b）。环状RNA和线性RNA一样包含有多种RNA修饰，目前研究较多的是N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)。作为最丰富的碱基修饰方式，m6A具有多种功能，例如参与调控拼接 (Adhikari et al. 2016)。为了研究环状RNA m6A修饰的功能，需在单碱基水平识别环状RNA的修饰位点。目前常用的基于methylated RNA immunoprecipitation sequencing (MeRIP-seq)方法无法做到单碱基水平的精度，而基于Oxford Nanopore Technologies（ONT）平台的单分子RNA直接测序虽然可以从单碱基水平检测RNA修饰，但常规流程只能检测具有poly(A)尾的转录本。与线性RNA不同，环状RNA为共价闭环结构，没有5' 端帽子和3' 端poly(A) 尾，所以常规方法无法用来进行环状RNA的ONT RNA直接测序。

JIPB近日在线发表了福建农林大学顾连峰课题组题为“Profiling of circular RNA N6-methyladenosine in moso bamboo (Phyllostachys edulis) using nanopore-based direct RNA sequencing”的论文。使用修改过的适用于环状RNA的反转录接头（包含10个简并碱基N）进行反转录。最后再连接上测序接头基于ONT测序平台进行RNA测序；通过ONT RNA直接测序数据识别环状RNA并鉴定环状RNA 的m6A修饰。这种方法不但可以应用在环状RNA这种特殊的RNA类型上，还可以应用到其他没有poly(A)尾的线性转录本类型上，为探究非编码RNA的表观转录组提供了新的思路。

图1 环状RNA的建库流程以及纳米孔RNA直接测序。首先提取样品总RNA（建议至少100μg以上，以富集足够的后续上样量）、通过RNase R消化线性RNA、给残留的线性RNA加poly(A)尾巴、去除含poly(A)尾的RNA和去除核糖体RNA 流程得到富集的环状RNA；随后将其打断并对RNA的3’末端进行去磷酸化处理，使用修改过的反转录接头进行反转录；最后再连接上测序接头基于ONT平台进行RNA直接测序。

课题组前期研究结果表明赤霉素对毛竹的节间伸长有明显的促进作用（Zhang et al. 2018）。在前期研究基础上利用本文建立的环状RNA直接测序方法获得了赤霉素处理下的环状RNA表观转录组信息，发现10%的环状RNA均具有m6A的修饰位点，并且在反向拼接位点附近具有富集现象。本文获得的表观修饰信息为后续研究m6A对环状RNA和线性转录本的拼接调控奠定了基础。

福建农林大学林学中心的博士生王永生和林学院的王慧慧完成了环状RNA文库构建和生物信息学分析工作，林学中心的博士生席飞虎完成了反转录接头的合成工作，科罗拉多州立大学的Anireddy S. N. Reddy教授和文中其他合作者也参与了本项目，福建农林大学林学中心顾连峰教授为本文通讯作者。本研究得到了国家重点研发计划“竹资源高效培育关键技术研究”项目(2018YFD060010101)和国家自然科学基金“毛竹环状RNA响应赤霉素诱导的分子机制研究”（31971734）的资助。