中山大学张锐组揭示mRNA m5C的序列结构特征和动态变化规律

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RNA修饰是真核生物重要的转录后调控方式。其中，5-methylcytosine（m5C）修饰广泛存在于tRNA和rRNA中，然而对于mRNA上是否存在m5C修饰，学界存在很大的争议：有研究团队认为，m5C在真核生物中分布十分广泛，mRNA上存在数千以至上万个m5C位点【1】；而另外的观点认为，这些m5C是实验误差造成的，真核生物的mRNA上几乎没有真实的m5C位点。这样的争议一方面是由于mRNA在总RNA中的占比很低，因此其他类型含m5C的RNA（如tRNA）会严重干扰m5C的绝对定量；另一方面，转录组范围的m5C精确测量所依赖的重亚硫酸盐测序（Bisulfite sequencing，BS-seq）存在噪音——重亚硫酸盐无法完全转化处于二级结构区域的C碱基，因此在实验中可能存在未被转化的“漏网之鱼”被错误地识别为m5C。

近日，中山大学张锐课题组于Nature Structural & Molecular Biology上发表了题为Genome-wide identification ofmRNA 5-methylcytosine in mammals的研究，揭示了m5C修饰在哺乳动物细胞系与组织的mRNA中的精确定位和动态变化；同时表明，mRNA上的m5C据有独特的序列和结构特征。

通过数据分析，作者发现已报导的“m5C位点”有一半以上是成簇分布于同一RNA分子上。这有可能是一种类似于A-to-I RNA编辑的机制，或者是重要的假阳性特征。进一步分析表明成簇的“m5C位点”通常集中在容易形成二级结构的高GC含量区域，而二级结构会阻碍重亚硫酸盐反应并造成假阳性。通过实验，作者发现成簇的“m5C位点”对针对NSUN2的RNA干扰不敏感，也不能被m5C抗体富集，因此可能是由实验引入的假阳性。根据这些特性，作者建立了一套新颖的生物信息学计算流程过滤噪音，得以精确的定位mRNA 上m5C。在NSUN2敲除的细胞系中，大多数使用该流程获得的m5C位点都失去了甲基。这些结果说明，mRNA上的m5C位点是确实存在的，但BS-seq本身存在噪音，需要小心谨慎地去除。

作者分析发现NSUN2依赖的m5C位点倾向于拥有一个3’富G的基序（motif），通常位于在一个小颈环结构的底部。这些特征与NSUN2的tRNA底物高度一致，进一步揭示了mRNA m5C 序列和结构特征的由来。此外还有一小部分m5C位点在NSUN2敲低/敲除的细胞系中维持较高的甲基化水平。这些不依赖于NSUN2的m5C位点拥有和NSUN2依赖的位点不同的序列和结构特征。通过在HeLa细胞中逐个敲低NSUN家族成员进行BS-seq，作者发现除了NSUN2，NSUN家族其他成员不调控mRNA m5C位点，暗示除了NSUN家族成员，可能存在新的甲基转移酶参与了不依赖于NSUN2 的mRNA m5C位点的催化。

作者进一步对7个人类组织与10个小鼠组织中转录组进行测序分析，分别确认了3212与2498个高置信度位点。结果发现，在不同组织中mRNA m5C位点的数量与甲基化水平有很大差异。在人和小鼠的睾丸、肝脏、心肌和骨骼肌，mRNA上有数百个高置信度的m5C位点，而在其他的一些组织则寥寥可数。另外，这些m5C位点在人和老鼠之间并不保守，说明它们很可能是受到顺式调控（cis-regulation）的。

图示:mRNA m5C分析流程和动态变化规律

这项研究开发的方法为mRNA m5C的研究提供了新的工具；其构建的哺乳动物mRNA m5C 精确图谱为发现mRNA上m5C修饰的调控和功能奠定了坚实的基础。

同期的News and Views中发表了Lukas Trixl 和 Alexandra Lusser 撰写的评述文章Getting a hold on cytosinemethylation in mRNA，评价张锐课题组开发的新计算方法增加了m5C检测的精确度，进一步提供了tRNA甲基化转移酶NSUN2介导mRNA甲基化的令人信服的证据。

据悉，中山大学生命科学学院特聘副研究员黄涛、博士生陈婉颖、博士生刘健恒为该论文的并列第一作者，张锐（生命科学学院教授、孙逸仙纪念医院逸仙医学讲座教授）为通讯作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41594-019-0218-x

制版人：小娴子

参考文献

1. Yang, X. et al. 5-methylcytosine promotesmRNA export—NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. CellRes. 27, 606–625 (2017).