张锐组揭示一个新的mRNA m5C修饰writer蛋白

来源：BioArt

mRNA修饰是一类新近发现的真核生物重要的转录和转录后调控机制，目前已报导数种mRNA修饰。mRNA修饰在细胞分化、发育、衰老和肿瘤等已知生物学过程中都起到重要的调控作用。该领域一个有趣的发现是几乎所有mRNA修饰的writer蛋白都存在多种类型的RNA底物。比如METTL16介导snRNA和mRNA的修饰，TRMT6/TRMT61A介导tRNA和mRNA的修饰，PUS家族蛋白介导tRNA和mRNA的修饰。因此一个很引人入目的假说是大多数mRNA修饰writer蛋白最开始的底物可能都是非编码RNA。在物种进化过程中，一些mRNA序列模拟了其非编码RNA底物的序列和结构特征，被加上了修饰。当mRNA上的修饰逐渐产生生物学功能，使物种有了更好的适应度，其writer蛋白开始和多种RNA底物共同进化，进而有了同一writer蛋白多种RNA底物共存的状态。

m5C修饰是一种真核生物中广泛分布的RNA修饰。近几年的研究发现tRNA、rRNA和mRNA上都存在m5C修饰。由于之前基于高通量测序的单碱基m5C鉴定技术容易造成假阳性现象，这一领域一直存在争议 【1】。2019年中山大学张锐课题组建立了一套全转录组水平高置信度鉴定mRNA m5C甲基化的技术，通过这一技术构建了哺乳动物细胞系与组织的mRNA m5C精确图谱，并发现mRNA存在两类m5C位点(命名为Type I和Type II 位点)，分别据有独特的序列和结构特征 【2】。Type I 位点在大多数组织和细胞类型中富集，位于一个茎-环结构的5’端，并且位点3’端有一个富含鸟嘌呤（G-rich）的基序。Type I位点的writer蛋白为NSUN2，一个同时可以介导tRNA TΨC环 5’端 m5C甲基化的writer蛋白。Type II位点具有较强的组织特异性，占比从1%-40%不等。Type II位点位于一个茎-环结构的环区，并且位点3’端带有一个TCCA基序。Type II位点的writer蛋白未知。

近日，张锐课题组在National Science Review上发表了题为Sequence- and structure-selective mRNA m5C methylation by NSUN6 in animals的研究，发现了Type II位点的writer蛋白NSUN6。通过哺乳动物多个组织Type II位点数目和所有已知甲基化转移酶表达的相关性分析，作者意外的发现NSUN6，一个特异的甲基化tRNA-Thr 和 tRNA-Cys 接收茎的甲基转移酶，跟Type II 位点数目有强相关性。CRISPR/Cas9敲除NSUN6后，Type II位点消失；而外源引入NSUN6可以使Type II位点甲基化水平恢复。作者进一步结合miCLIP（methylation miCLIP）数据分析确定NSUN6特异性的结合Type II位点区域。这些证据证实NSUN6为特异的Type II 位点writer蛋白。为了进一步研究Type II底物的序列特征，作者构建了一个高通量甲基化水平报告系统进行数千种人工突变引入。通过这一系统揭示NSUN6对TCCA基序的改变十分敏感，而附近碱基组成和结构特征可以调控NSUN6对Type II位点的催化水平。通过polysome BS-seq和报告基因等实验，作者发现Type II m5C有可能涉及到mRNA翻译的调控。

作者的这些发现揭示，就如其他mRNA修饰，mRNA上两类m5C的writer蛋白都是共同靶向多种底物（tRNA和mRNA）。这一特点也带来了mRNA修饰领域一个重点和难点问题，即如何特定的揭示比如mRNA修饰的功能。为解决这一问题，作者以NSUN6为例构建了一个研究框架：1. 结合tRNA和mRNA底物的序列结构特征和之前发表的NSUN6-tRNA复合物晶体结构 【3】，通过Rosetta比较模型和RNP-denovo算法，模拟NSUN6-tRNA和NSUN6-mRNA的结合模型。2. 通过模型揭示NSUN6 可能的分别跟tRNA和mRNA相互作用的关键位点。3. 通过在NSUN6蛋白特定位点引入点突变，发现可能只识别单一底物(mRNA)的突变体蛋白。这一研究框架可以在将来用于所有多种类型底物writer蛋白的功能研究，揭示特定RNA底物修饰的功能，为mRNA修饰的研究开辟了崭新的思路。

图示：NSUN6介导的Type II mRNA m5C的序列特征以及NSUN6-tRNA/mRNA复合物模拟

揭示特定类型mRNA修饰的writer蛋白是研究mRNA修饰功能的基础和最重要的科学问题之一，伴随而来的是激烈的学术竞争。NSUN6作为mRNA Type II m5C位点的writer蛋白同时被国际上其他两个课题组独立发现，并投稿在末发表预印本服务器BioRxiv 【4-5】。