张志国团队报道哺乳动物细胞中父本组蛋白在前导链和滞后链上的分布不完全对称学术资讯

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真核细胞在进行细胞分裂时，除了需要将遗传物质，也就是DNA序列进行精确复制，还需要将表观遗传信息传递给下一代，从而控制细胞命运。表观遗传信息包括DNA修饰（甲基化等），组蛋白翻译后修饰，非编码RNA和染色质高级结构等。其中，组蛋白作为构成核小体的骨架单位，其翻译后修饰的调控及遗传机制受到广泛关注。

染色质复制时，随着遗传物质的加倍，组蛋白也需要加倍，从而满足核小体组装的需求。之前的研究表明，新合成组蛋白将携带和父本组蛋白截然不同的翻译后修饰。子代细胞需要重建表观遗传状态，从而维持细胞的表型或进行分化，因此组带白修饰向新合成DNA链的精确传递就显得尤为重要。早期的研究者们推测，父本组蛋白随机等分到新合成的两条DNA上，即前导链（leading strand）和滞后链（lagging strand）得到相等数量和相同状态的父本组蛋白，但该理论并未得到实验证据支持。

为了深入探讨这一过程及其调控机制，哥伦比亚大学医学院张志国教授课题组于传贺和甘海云博士等人数年前开发了eSPAN方法，通过二代测序对某一蛋白质（包括带特定修饰的组蛋白）在酵母细胞中的复制叉两条子链的结合进行定量【1】。通过这一方法首次证明，父本组蛋白在前导链和滞后链上的分布并不是完全随机和对称【2,3】。Dpb3和Dpb4，作为前导链DNA聚合酶Polε的亚基，介导父本组蛋白向前导链上的转移，而MCM2-Ctf4-Polα这一条通路则促进父本组蛋白向滞后链的转移。

图1. eSPAN工作模式图

为了在更复杂的真核细胞体系中进行验证，并探索其与生理疾病可能存在的联系，张志国教授课题组李治明等人进一步将eSPAN方法拓展到了哺乳动物细胞中。近日，他们在Science Advances杂志上发表了这一最新成果：DNA polymerase α interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands。

该研究结合了最新开发的CUT&Tag技术，成功地就eSPAN应用到小鼠胚胎干细胞中。CUT&Tag作为传统染色质免疫沉淀（ChIP）的替代，将转座酶Tn5与蛋白A（Protein A）融合，提高了ChIP-seq的灵敏度和特异性，并极大地简化了二代测序所需的建库步骤。该研究巧妙地设计了一个寡核苷酸替代（oligo-replacement）的步骤，在DNA片段两端加上不同的测序接头，保留了链的方向性，使其能计算前导链和滞后链的相对比例，从而确定目标蛋白在复制叉两侧是否有偏向性及偏向性大小（图1）。通过优化的eSPAN方法，李治明等人证明了哺乳动物细胞中父本组蛋白在前导链和滞后链上的分布同样不完全对称。
MCM2或Pole3/Pole4（Dpb3/Dpb4同源蛋白）的突变可导致父本组蛋白向滞后链或前导链上的转移发生障碍，证明了这两条通路在酵母和哺乳动物中高度保守。此外，该方法对于研究DNA复制相关的其他生物学过程，如DNA错配修复，染色质姐妹单体分离等也具有重要的应用价值。更重要的是，作为合成RNA-DNA引物用于启动DNA复制的DNA聚合酶Polα，能够结合组蛋白H3-H4，且这一活性可促进父本组蛋白向滞后链的转移。在酵母和小鼠胚胎干细胞中突变Polα的组蛋白结合结构域可导致父本组蛋白向滞后链的转移受损。此前, Polα是否直接参与父本组蛋白的转移过程仍属未知。这一新发现不但揭示了其新的分子机制，也回答了MCM2作为结合在前导链上的DNA解旋酶复合物中的一员是如何将父本组蛋白转移到滞后链上的这一关键问题（图2）。

图2. 父本组蛋白向前导链和滞后链转移的两条分子通路
有意思的是，该研究同时还发现所有使得父本组蛋白转移受损的突变都能够导致本该被抑制的基因组重复序列，如内源性逆转录病毒（ERV）等发生异常转录激活。初步证据显示，这一现象很有可能是由突变细胞中异常的表观遗传状态，尤其是抑制性组蛋白修饰(如H3K9me3) 发生显著异常所导致。ERV激活可以刺激癌细胞对肿瘤免疫疗法的反应，目前被视为很有前景的联合治疗手段。该研究也为这一领域带来了新的启示。
据悉，该研究主要由张志国教授课题组李治明博士等人完成，同时也得到了中科院生物物理所许瑞明教授课题组和法国居里研究所陈春龙教授课题组的大力支持。

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