丙酮酸激酶M1型和M2型研究的戏剧性逆转和对Warburg效应的反思

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原标题：特别关注丨丙酮酸激酶M1型和M2型（PKM1/2）研究的戏剧性逆转和对Warburg效应的反思

糖代谢异常是肿瘤的重要特征之一，具体表现在1956年德国生物学家Warburg提出的Warburg效应——即使在氧气充足的情况下, 肿瘤细胞仍大量摄取葡萄糖产生乳酸（有氧糖酵解）。丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase，PK）是调节糖酵解最后一步反应的关键酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 和ADP反应生成丙酮酸和ATP。丙酮酸激酶包括红细胞/肝型丙酮酸激酶（PKLR）和肌肉型丙酮酸激酶（PKM），PKM又有两个isoform，分别为PKM1和PKM2，近年来围绕PKM1和PKM2在肿瘤中的作用有大量的研究，然而存在不少的争议甚至有些是误导性研究，很多关键的科学问题扑朔迷离。有鉴于此，在多位从事肿瘤代谢相关研究的专家学者的建议下，BioArt特别邀请到了厦门大学林舒勇教授撰文，另外组织了林圣彩、赵世民、张华凤、杨巍维、江鹏、胡泽平等多位相关领域的权威专家进行意见征求与审稿，由于篇幅所限，本文只讨论围绕PKM在肿瘤代谢中的作用，而更复杂的涉及到PKM激酶活性的内容，后续BioArt会另行邀请业内专家讨论。

代谢重塑是肿瘤的共同特征之一，改变对葡萄糖、氨基酸和脂质等营养物质的利用效率和方式会为肿瘤细胞带来生长、生存、增殖和迁移等方面的优势。最著名的肿瘤代谢重塑现象可属“瓦伯格效应”这种在肿瘤中糖代谢异常活跃的改变。

糖代谢途径中有不少同工酶的存在，而分析肿瘤和正常细胞中这些同工酶的差异性表达正是肿瘤糖代谢研究领域的重要思路之一。这些同工酶中，对肌肉型丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase M，PKM）的差异性表达的研究恐怕是最为引人注目。PKM基因编码的丙酮酸激酶负责催化糖酵解途径的最后一步反应，即将磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）上的磷酸根转移到ADP上，从而产生丙酮酸（Pyruvate）和ATP。有趣的是，编码PKM的基因可以通过对mRNA的差异性剪接选择第九个外显子或者第十个外显子而表达出PKM1和PKM2两种同工酶。PKM1和PKM2的表达有很大差异：PKM1主要在肌肉和脑这些对能量需求旺盛的分化终末细胞中表达，而PKM2则主要在胚胎细胞、干细胞和肿瘤细胞这些对合成代谢需求强的细胞中表达。虽然二者催化相同的反应，但仅有的22个氨基酸的差异赋予了PKM1和PKM2不同的属性，包括多聚化、酶活力和调控方式等。由于篇幅限制，本文不在此详述。

关于肿瘤中PKM亚型的研究大概始于上世纪70年代。人们在多种肿瘤中检测到了PKM2的表达，令人吃惊的是，在大鼠肿瘤模型中，在正常组织中本应表达的PKM1在对应的肿瘤组织中被PKM2替代。2008年Lewis C. Cantley团队先是对人类肿瘤组织和癌细胞系中M1型和M2型丙酮酸激酶的蛋白水平进行了分析，发现M2型丙酮酸激酶在肿瘤中高表达。接着，他们采用敲低内源性的PKM的mRNA，再重新表达外源的PKM1或PKM2的cDNA的策略，研究两种同工酶在肿瘤中的差异。通过移植瘤实验，他们发现PKM2具有促进肿瘤生长的优势【1】。然而，五年之后的2013年，Matthew Vander Heiden团队的研究采用了敲除PKM基因中PKM2特有的第十个外显子的策略，发现PKM2的缺失反而会加速肿瘤的生长【2】。为了调和这两个乍一看相抵触的发现，人们结合2011年Cantley团队关于PKM2受活性氧刺激时会使葡萄糖代谢流向磷酸戊糖途径【3】，2012年Craig B. Thompson团队关于PKM2促进糖酵解中间代谢物流向丝氨酸合成途径【4】，以及2015年Matthew Vander Heiden团队关于PKM1通过抑制核酸合成而抑制细胞生长【5】等系列发现，逐渐形成了一个有些玄学意味的调和假说，即以PKM2替代PKM1，或者减少PKM2表达，都下调了PKM整体活性，这样可能使得糖代谢向PKM上游的合成代谢分支途径（如丝氨酸途径和磷酸戊糖途径）转向，而累积合成代谢的中间代谢物，一方面作为肿瘤增殖和生长的原料，另一方面又能促进糖酵解和瓦伯格效应。

然而，2014年Jasom W. Locasale团队的对肿瘤瓦伯格效应相关的代谢谱的研究发现，丙酮酸激酶活性的变化和糖酵解中间代谢物的累积、糖酵解速率和瓦伯格效应都没有明显的联系【6】，这给了上述的调和理论打了个问号，也进一步对原先对PKM2促肿瘤生长的结论提出了挑战。为了解决PKM同工酶的迷思，2018年Nobuhiro Tanuma团队构建了新的基因敲入小鼠模型，分别以和内源PKM表达接近的水平在小鼠中只表达PKM1或者PKM2亚型。结果显示，在致癌剂或癌基因诱导等多种肿瘤模型中，PKM1都促进了肿瘤的生长，而PKM2则抑制肿瘤生长。PKM1肿瘤模型中尽管生物合成途径并未受明显影响，但丙酮酸激酶活性和糖酵解速率都比野生型增高【7】，这给了PKM同工酶之争一个直截了当的体内数据的回答。这也暗示我们，肿瘤中PKM2高表达可能和肿瘤中高表达的抑癌因子p53最初被认为是癌基因一样是个误会。因此，需要重新审视Lewis C. Cantley于2008年发表的关于“PKM2具有促进肿瘤生长的优势”的论文（BioArt注：该成果发表于Nature杂志，目前被引次数超过2000次）【1】，也就是说关于PKM2到底是不是促进肿瘤发生发展的元凶的问题需要慎重考虑，而不是盲目的引用作为论据支撑。总之，人们在关注PKM2的表达水平的同时，也应该留意其在体内环境的功能的变化，是否存在其抑癌功能损伤造成补偿性高表达的可能【8】。

值得一提的是，瓦伯格效应的核心是糖酵解在肿瘤细胞中的大幅提高。然而，不少人会把这个概念曲解成肿瘤会选择提高糖酵解而降低氧化磷酸化供能。其实，这样的解读并不准确。正如Nobuhiro Tanuma团队的研究显示的，PKM1促肿瘤生长的模型中并未减少氧化磷酸化的水平。实际上，很多表现出高糖酵解活性的肿瘤并未出现线粒体活性的异常和氧化磷酸化的抑制，而仅仅是葡萄糖代谢进入TCA和氧化磷酸化的流量相对于大幅提高的糖酵解而言提升的程度不成比例。而丙酮酸本身除了进入TCA循环，用于氧化磷酸化之外，还向乳酸或乙酸【9】分流，甚至是进入线粒体后仅借用TCA循环的一步反应生成柠檬酸而进入脂质从头合成途径的分流，都可能造成氧化磷酸化途径的上升比例相对糖酵解而言较低的表象。近年来的研究更是发现不少肿瘤中氧化磷酸化是上调，而非被抑制。目前针对氧化磷酸化开发的肿瘤治疗药物中，有效的策略也多是抑制氧化磷酸化，而非提高氧化磷酸化【10】。

人们常常误解的还有“限速酶”这一经典概念。对于糖酵解而言，人们常常简单粗暴地提到己糖激酶（Hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）和丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）是三个限速步骤，其中以PFK最为关键，因其本身是调控糖酵解的众多机制的靶点。然而，要明确的是，这三个限速酶的提出是以红细胞无氧酵解为背景的，而在不同的具体条件下，根据代谢流量和流量的差异，所谓限速酶并非一成不变。比如2014年Jasom W. Locasale团队运用同位素示踪等技术对肿瘤有氧糖酵解代谢组的分析发现，通常不太引人关注的GAPDH反而是最重要的限速酶。更重要的是，他们发现所谓的经典限速步骤既存在可预期的正调控机制，也存在着负反馈的可能，包括在某些条件下，抑制通过PFK的代谢流反而会提高糖酵解速率【6】。另外，杨巍维教授组也发现了巨噬细胞导致肿瘤细胞中的磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase 1，PGK1）由非限速酶变成限速酶的情况，这也说明所谓限速酶的定义要视具体情况而定【11】。

而糖代谢流量的差异也并非肿瘤特有，面对因层层“剥削”造成的低氧条件的体内的正常组织【12】，以及部分有旺盛增殖需求的细胞【13】等等都完全可能存在与肿瘤类似的“代谢溢流”（overflow metabolism）的情况，从而使体内正常细胞的代谢流与以往体外细胞培养模型得到的结论有所不同。这就警示人们不应该机械地套用“限速酶”的概念，而应根据具体情况进行具体分析。

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参考文献

1. Christofk HR, Vander Heiden MG, Harris MH, Ramanathan A, Gerszten RE, Wei R, Fleming MD, Schreiber SL, Cantley LC. The M2 splice isoform of pyruvate kinase is important for cancer metabolism and tumour growth. Nature 2008 Mar 13;452(7184):230-3.

2. Israelsen WJ, Dayton TL, Davidson SM, Fiske BP, Hosios AM, Bellinger G, Li J, Yu Y, Sasaki M, Horner JW, Burga LN, Xie J, Jurczak MJ, DePinho RA, Clish CB, Jacks T, Kibbey RG, Wulf GM, Di Vizio D, Mills GB, Cantley LC, Vander Heiden MG. PKM2 isoform-specific deletion reveals a differential requirement for pyruvate kinase in tumor cells. Cell. 2013 Oct 10;155(2):397-409.

3. Anastasiou D, Poulogiannis G, Asara JM, Boxer MB, Jiang JK, Shen M, Bellinger G, Sasaki AT, Locasale JW, Auld DS, Thomas CJ, Vander Heiden MG, Cantley LC. Inhibition of pyruvate kinase M2 by reactive oxygen species contributes to cellular antioxidant responses. Science. 2011 Dec 2;334(6060):1278-83.

4. Ye J, Mancuso A, Tong X, Ward PS, Fan J, Rabinowitz JD, Thompson CB. Pyruvate kinase M2 promotes de novo serine synthesis to sustain mTORC1 activity and cell proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 May 1;109(18):6904-9.

5. Lunt SY, Muralidhar V, Hosios AM, Israelsen WJ, Gui DY, Newhouse L, Ogrodzinski M, Hecht V, Xu K, Acevedo PN, Hollern DP, Bellinger G, Dayton TL, Christen S, Elia I, Dinh AT, Stephanopoulos G, Manalis SR, Yaffe MB, Andrechek ER, Fendt SM, Vander Heiden MG. Pyruvate kinase isoform expression alters nucleotide synthesis to impact cell proliferation. Mol Cell. 2015 Jan 8;57(1):95-107.

6. Shestov AA, Liu X, Ser Z, Cluntun AA, Hung YP, Huang L, Kim D, Le A, Yellen G, Albeck JG, Locasale JW. Quantitative determinants of aerobic glycolysis identify flux through the enzyme GAPDH as a limiting step. Elife. 2014 Jul 9;3. doi: 10.7554/eLife.03342.

7. Morita M, Sato T, Nomura M, Sakamoto Y, Inoue Y, Tanaka R, Ito S, Kurosawa K, Yamaguchi K, Sugiura Y, Takizaki H, Yamashita Y, Katakura R, Sato I, Kawai M, Okada Y, Watanabe H, Kondoh G, Matsumoto S, Kishimoto A, Obata M, Matsumoto M, Fukuhara T, Motohashi H, Suematsu M, Komatsu M, Nakayama KI, Watanabe T, Soga T, Shima H, Maemondo M, Tanuma N. PKM1 Confers Metabolic Advantages and Promotes Cell-Autonomous Tumor Cell Growth. Cancer Cell. 2018 Mar 12;33(3):355-367.

8. Allen AE, Locasale JW. Glucose Metabolism in Cancer: The Saga of Pyruvate Kinase Continues. Cancer Cell 2018 Mar 12;33(3):337-339.

9. Liu X, Cooper DE, Cluntun AA, Warmoes MO, Zhao S, Reid MA, Liu J, Lund PJ, Lopes M, Garcia BA, Wellen KE, Kirsch DG, Locasale JW. Acetate Production from Glucose and Coupling to Mitochondrial Metabolism in Mammals. Cell. 2018 Oct 4;175(2):502-513.e13.

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11. Zhang Y, Yu G, Chu H, Wang X, Xiong L, Cai G, Liu R, Gao H, Tao B, Li W, Li G, Liang J, Yang W. Macrophage-Associated PGK1 Phosphorylation Promotes Aerobic Glycolysis and Tumorigenesis. Mol Cell. 2018 Jul 19;71(2):201-215.e7.

12. Brahimi-Horn MC, Pouysségur J. Oxygen, a source of life and stress. FEBS Lett. 2007 Jul 31;581(19):3582-91.

13. Sun H, Chen L, Cao S, Liang Y, Xu Y. Warburg Effects in Cancer and Normal Proliferating Cells: Two Tales of the Same Name. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2019 May 6. pii: S1672-0229(18)30171-2.