加州大学圣地亚哥分校熊伟课题组和频振动光谱显微镜方向取得重大进展

来源：X一MOL资讯

分子自组装是指分子在不受人为干预的情况下，自发组成有序结构的过程。非线性光学，听起来与化学几乎毫无关联。然而在加州大学圣地亚哥分校（UCSD）熊伟课题组，这两者美妙地结合在了一起，并且揭示了水分子在自组装系统中独特的氢键动力学和其对自主装系统的力学性质的影响。这个研究的最新成果于近期发表在PNAS 等期刊上。那么，这两个看似毫不相关的领域是如何擦出火花的呢？

自组装体系存在于生活和科技的方方面面，它们通常表现出与周围环境不同的化学结构和性质，并且有可能表现出空间各异性（spatial heterogeneity）。因此，如果能够在一个繁复动态的系统中，有选择性地检测自组装系统，并且检测它的化学结构、分子动力学以及在空间的形貌，这将有助于解析自组装从分子层面至介观层面的结构、动力学和性质的关系。近些年来，熊伟课题组致力于开发出更高维度的和频振动光谱显微镜（Vibrational Sum Frequency Generation Microscopy, VSFGM），从而从自组装系统中可以获得更清晰的多维度分子信息，实现“升维打击”。目前课题组已经开发出世界上首台全共线外差和频振动光谱显微镜（Fully-Collinear Heterodyne-detected VSFGM）和首台瞬态和频振动光谱显微镜（Transient VSFGM），并利用这两台全新的显微镜研究了一个分子自组装体系，相关工作分别发表在ACS Photonics 和PNAS 上。该显微镜有望在未来用于更多分子自组装体系、高分子体系和软物质方面的研究。下面就此系列性研究成果做一简单的回顾。

1. 和频振动光谱显微镜

和频光谱（Sum Frequency Generation，SFG）技术是一种相干的二阶非线性光学过程，为加州大学伯克利分校的华人教授沈元壤于1987年首次报道。当两束脉冲激光同时照射到同一样品时，会产生频率等于两束入射光之和的光信号，这就是和频光谱信号。因为和频光谱是一种二阶的过程，只有具有非对称中心的样品才会给出信号。这样的具有非对称中心的样品包括表面/界面，以及具有非对称中心的生物样品和自组装结构等。

当这两束光中有一束是红外光时，这个过程被称作和频振动光谱，可以给出处于非对称中心环境的化学键振动光谱。比如用常规的光谱手段（红外光谱或者拉曼光谱）来测量水的信号时，界面水的信号会完全被体相水的信号所掩盖；但是若使用和频振动光谱来研究水，则体相水处于具有对称中心的环境中，从而不会产生信号，所以观测到的信号来源于界面水。另外的一个例子是研究植物中的纤维素：在植物中，除了纤维素外，还有一种叫做半纤维素的物质。半纤维素与纤维素具有类似的构成，因此使用红外或者拉曼是无法进行区分的。但是利用和频振动光谱进行研究时，半纤维素因为具有随机和非结晶性的结构从而基本没有信号，从而可以实现对植物中纤维素的选择性研究。

通过将和频振动光谱技术与显微镜技术结合，则可以观测到具有非对称中心环境的化学键在空间中的分布，并有利于识别微小信号。

2. 全共线外差和频振动光谱显微镜

熊伟课题组开发了一个全共线外差和频振动光谱显微镜，并用它研究了一个自组装体系。通常的光学检测器只测量光强（I=E2），从而丢失了相位的信息。在SFG中，相位信息代表着分子的绝对取向。将外差法（Heterodyne-detection）引入到VSFGM，通过将信号与另一束频率相同的已知光（被称作局部振荡器，Local Oscillator）一起送到检测器中形成干涉条纹，可以获取相位信息，并判断每个区域中分子的绝对取向。传统的外差法采用的是迈克尔逊干涉仪模式，对仪器的力学稳定性甚至样品的平整度有很高要求，因此显微图像中的相位信息可重复性较差。为了解决这一问题，熊伟课题组搭建了第一台全共线的外差和频振动光谱显微镜。在这种全共线的模式下，该显微镜的相位稳定性，相较于迈克尔逊干涉仪模式，提高了至少9倍，并且不受样品平整度的影响。

他们用这个显微镜研究了一个旋涂在金表面的分子自组装体系——SDS@2β-CD（十二烷基硫酸钠和β-环糊精）。这是一种可以用来模拟蛋白质组装的晶格自组装（crystalline lattice self-assembly）体系，而且根据前人的研究（Nat. Commun., 2017, 8, 15856），它具有多种不同的形貌，并且每一种都在蛋白质自组装中有所对应。

图1. (a) 蛋白质可以自组装形成各种不同形貌的结构；(b) SDS@2β-CD可以自组装成具有类似形貌的结构。图片来源：Nat. Commun., 2017, 8, 15856

通过外差法研究体系中的CH键的相位，熊伟课题组发现SDS@2β-CD超分子自组装形成了20-100 μm2大小的区域，并且每个区域具有不同的取向。如果不使用显微技术，则这些朝向相反区域的信号会彼此抵消。这个结果表示这个自组装系统只在百平方微米级别是有序的，超出这个范围，这个系统变得无序。熊伟课题组又从理论上分析了这个自主装系统VSFG信号的来源：β-CD分子的手性在最后形成的聚集体中被保持，形成不对称中心，从而产生VSFG信号。因此，该技术理论上可以用于具有手性的样品的测试。这部分的工作发表在了ACS Photonics 上（ACS Photonics, 2017, 4, 1839）

图2. (a) 相较于传统的迈克尔逊干涉仪模式，全共线模式的相位稳定性提高了9倍。小图：全共线模式在2小时内都保持着出色的稳定性。(b) 每种颜色代表一种谱线。其中最常见的两种在 (d) 中显示：它们正好具有相反的符号，代表取向相反的两种结构。(c) 青色谱线是将 (b) 中青色区域内的谱线进行平均，来模拟如果不使用显微技术将会得到的结果：由于不同取向的谱线进行抵消，将会几乎不可见。(d) 最常见的两种谱线。在纵轴方向它们进行了移动以使得能更好的观察它们。图片来源：ACS Photonics, 2017, 4, 1839

3. 瞬态和频振动光谱显微镜

之后，熊伟课题组继续在研究来自于自组装体系本身和其中水分子的羟基，以及水分子与自组装系统之间的氢键作用动力学。这个自组装体系在OH区域有三个峰，分别在~3050、~3280和~3400 cm-1——为与自组装有强氢键作用的水分子，以及β-CD的二级羟基、一级羟基的信号。结合3050 cm-1峰的位置相较于一般的水的OH峰明显红移，这说明样品中的强结合水与β-CD形成了很强的氢键，从而使得这些强结合水整体跟从β-CD形成了具有非中心对称性的结构。这意味着，水分子和β-CD的氢键作用足够强具有手性，以至于聚集体SDS@2β-CD手性通过氢键作用传递给了水分子。这一部分的工作发表在了JPCB上（J. Phys. Chem. B, 2019, 123, 6212-6221）。

以上工作的令熊伟课题组对这个体系产生了更多的好奇：是否有氢键的直接证据？还有这些结合水是如何在自组装中分布的呢？水分子对这些自组装系统的性质起着什么样的作用？于是他们搭建了世界首台瞬态和频振动显微镜。对于瞬态过程，先用一束高能量的被称为泵浦（pump）的光来激发样品，随后测量有和没有泵浦时VSFG信号的差值，通过调节泵浦光与VSFG信号之间的延迟时间完成对动力学的测量。

通过对不同区域的动力学进行测量，他们发现3150 cm-1有一个正的信号。由于这个信号相对于~3050 cm-1的结合水峰发生了蓝移。这个信号来源于结合水与二级羟基之间氢键的破坏与恢复。这项研究最有趣的显现是熊伟课题组发现不同区域的这个~3150 cm-1的动力学过程略有不同。在有的区域，可以用一个指数衰变函数来拟合，而在其他的区域则是先上升后下降的过程，需要用两个指数函数来拟合（其寿命分别称之为t1和t2）。此外，在不同区域的t1和t2会不同，而在同一个区域中不同的位置，它们是相同的。

氘代实验证实t1对应的是O…O距离的波动，而t2则对应的是氢键通过福斯特共振能量转移过程（FRET）进行恢复。因为FRET的速率与供体-受体距离以及受体的数目有关，所以t2可以用来描述不同区域水合程度的指标。根据熊伟课题组的模型，这些自组装区域中的水合程度十分不同：有的自组装区域平均每一个β-CD只有两个水分子，而在离其不远的其他区域则会有六个水分子结合在β-CD（这里的水合程度指的是与β-CD二级羟基形成强氢键的结合水）。

以往对SDS@2β-CD的研究表明这个自组装体系中同时具有柔性和刚性。熊伟课题组的研究表明，这些与自组装体系有强氢键作用的水可能对系统的力学作用起着很大的作用。因为水合程度的不同，各自组装区域的超快的氢键动力学有所不同，而这些氢键可以影响自组装体系的柔性。在另一方面，同一个自组装区域中的氢键动力学是高度一致性，这反映了这个系统的刚性。因此控制水合对未来类似体系的设计可能起到很大的作用。这部分的工作发表在了PNAS 上（PNAS, 2020, 117, 23385-23392）。

图3. (a) 通过谱线拟合，我们发现这个自组装体系在OH区域有三个峰，分别为与自组装有强氢键作用的水分子, 以及β-CD的二级羟基,一级羟基的信号。(b & c) 两个不同区域的瞬态动力学。(d & e) 这两个瞬态动力学正信号分别的积分结果。图片来源：PNAS, 2020, 117, 23385-23392