SB系统的开发，可直接穿透细胞，改善了对基因插入的控制

来源：iNature

原标题：Nature Biotec：SB系统的开发，可直接穿透细胞，改善了对基因插入的控制

Sleeping Beauty（SB）转座子系统是哺乳动物细胞中一种有效的非病毒基因转移工具，但其广泛使用受到DNA载体转座酶基因活性不受控制，基因组不稳定的风险以及无法直接使用该转座酶蛋白的限制。

2019年11月4日，欧洲分子生物学实验室Orsolya Barabas及德国维尔茨堡大学Michael Hudecek共同通讯在Nature Biotechnology 在线发表题为"A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion"的研究论文，该研究设计创建具有增强的溶解性和稳定性的SB转座酶（高溶解度SB，hsSB）。该研究证明，hsSB可以与转座子DNA一起传递，以遗传修饰细胞系和胚胎，造血和诱导多能干细胞（iPSCs），克服了不受控制的转座酶活性。

研究人员使用hsSB生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞，在体外和异种移植小鼠中均显示出强大的抗肿瘤活性。有趣的是，该研究发现hsSB可自发穿透细胞，从而无需使用转染试剂即可修饰iPSC和生成CAR T细胞。hsSB每个基因组仅进行两次整合。总之，该技术由于其简单性和多功能性，与目前的标准相比，将大大降低制造成本，并有助于增加基因和细胞疗法的应用。

细胞和生物体中引入所需的转基因已成为研究和生物技术的关键技术，离体工程改造的人类细胞的临床应用证明了其在再生医学和癌症治疗中的治疗潜力。例如，最近将重组基因的T细胞与含有CAR的遗传信息一起使用已成为癌症治疗的新支柱，在白血病和淋巴瘤治疗中表现出显著的应答率。在这些疗法中，CARs作为合成免疫受体，可为T细胞提供针对恶性肿瘤相关抗原的新特异性，从而指导免疫系统攻击和根除肿瘤细胞。

高溶解度SB蛋白变异体的设计和表征

为了引入CAR基因，当前的方案依赖于病毒载体，该病毒载体提供有效的基因转移，但是需要漫长而昂贵的生产才能用于临床。病毒载体编码的抗原决定簇也具有促炎反应的风险，转录区域的优先整合可能会导致不利的基因组变化。非病毒载体的使用可以提高安全性并降低成本，但是受到基因转移效率，有限的转基因大小和载体DNA或RNA的细胞毒性的限制。例如，非病毒基因组编辑核酸酶可以简单，低成本地进行特定位点的基因组修饰，但它们依赖于DNA插入的同源性定向修复，通常在原代细胞中很少发生。

通过直接hsSB递送进行高效的细胞工程

DNA转座子是基因传递的另一种非病毒替代物。它们包含两个基本成分：转座酶和转座子DNA，常规地，两种组分均作为质粒DNA载体提供，并且转座酶在靶细胞中表达。表达后，转座酶蛋白特异性结合货运载体的转座子末端，切除转基因并将其整合到靶细胞的基因组中（转座）。随着转座子能够插入DNA，它们引起的转基因效率与慢病毒载体相似。同时，它们在免疫原性，插入特性，货物容量（最大20–150 kb），临床实施的复杂性和成本方面具有良好的属性。

广泛使用的转座子系统是SB，它是从鱼类基因组中的非活性拷贝重建的合成元件。由于其在脊椎动物中的高插入效率，SB已被用于功能基因组学，癌症基因发现，转基因和基因治疗应用。在医学领域，SB已用于临床1或2期临床试验中，用于治疗性细胞的体外工程改造，包括生产用于癌症免疫疗法的CAR T细胞。

然而，包括SB在内的当前转座子系统的一个重要缺点是靶细胞中发生的转座事件没有得到很好的控制。特别是，使用转座酶编码的DNA会引起蛋白质表达的延长。对转座酶暴露的时间和动力学缺乏控制会带来进行性和不受控制的转座，细胞毒性。对于SB，蛋白质聚集，低稳定性和低溶解度仍然是蛋白质生产和递送的主要瓶颈。

hsSB转座酶具有固有的细胞穿透特性

在该研究中，基于过度活跃的SB100X变体的晶体结构，使用了合理的蛋白质设计来创建具有增强的溶解性和稳定性的SB转座酶（高溶解度SB，hsSB）。该研究证明，hsSB可以与转座子DNA一起传递，以遗传修饰细胞系和胚胎，造血和诱导多能干细胞（iPSCs），克服了不受控制的转座酶活性。研究人员使用hsSB生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞，在体外和异种移植小鼠中均显示出强大的抗肿瘤活性。有趣的是，该研究发现hsSB可自发穿透细胞，从而无需使用转染试剂即可修饰iPSC和生成CAR T细胞。hsSB每个基因组仅进行两次整合。

总之，该技术由于其简单性和多功能性，与目前的标准相比，将大大降低制造成本，并有助于增加基因和细胞疗法的可及性。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z