改造酵母使其在细胞表面表达最大的纤维素小体复合物学术资讯

来源：中国生物技术网

纤维素生物质的可持续利用是一种生产有价值化合物的理想的方法，但是难降解纤维素的水解既复杂又费时。一些纤维素分解细菌产生了名为“纤维素小体”的多酶复合物，可有效降解纤维素。因此，在工业酵母中构建纤维素小体一直是科学家追求的目标。然而，由于纤维素基因的大小和复杂性，使得该研究具有很高的挑战性。

本实验中研究人员对克鲁维酵母进行了改造，使其在细胞表面表达“最大的纤维素分解复合物”，该复合物最多可容纳63种酶，这是迄今为止酵母中最大的工程化纤维素小体。由于纤维素酶在纤维素小体中的协同作用，该工程酵母显示出更高的降解效率，并且从纤维素底物中释放的还原糖和乙醇的量明显高于以前的任何构建体。

纤维素小体是由高温梭菌和其他厌氧性纤维素分解细菌产生的高效超分子酶复合物。典型的热纤梭菌纤维素酶体由一个中央非酶支架的蛋白亚基（称为“纤维素酶融合蛋白A”（CipA））和九种I型黏附蛋白组成。CipA包含一个不可分割的纤维素结合模块（CBM），该模块可结合纤维素底物。整个支架蛋白和酶亚基通过CipA的II型码头蛋白与三种表面锚定蛋白SdbA，Orf2p或OlpB之一的II型粘着蛋白之间的相互作用连接到细菌细胞表面。“外层蛋白B”（OlpB）通常包含7种II型粘着蛋白。

纤维素蛋白的示意图。（A）具有不同数目的粘着蛋白和CBM的仿生支架（CipA）。在支架蛋白名称中，“ B”代表CBM的数量，“ C”代表粘着蛋白的数量。例如，CipA1B9C表示CipA中存在一个CBM和九个黏附素。（B）与dockerin T融合的真菌纤维素酶。（C）具有7种II型黏附蛋白和ScGPI细胞表面锚定的外层支架蛋白B（OlpB）。（D）ScafT含有CBM和黏附素T。（E）本研究中使用的工程酵母宿主概观。（F）在马克斯克鲁维酵母的细胞表面上具有63种酶的工程化的纤维素复合体的示意图。

近年来，几组研究人员成功地在酿酒酵母细胞表面表达了微型化的纤维素体，称为“微型纤维素体”，并使用微晶纤维素证明了其纤维素分解和乙醇生产的能力。与游离或固定化酶相比，微纤维素酶中的酶显示出增强的活性。但是，微纤维体仅包含少量粘着蛋白，因此只能容纳几种酶，从而限制了酶的协同作用。由于CipA和OlpB基因的粘附素中大量的TR，缺乏稳定的染色体整合策略，低蛋白表达和宿主的分泌能力，因此将大型纤维素复合体工程化到酵母基因组中仍然具有很高的挑战性。现有策略使用游离质粒表达微纤维素体，以提高蛋白质产量。然而，游离表达需要诱导和恒定选择，因此增加了生产成本并增加了稳定性问题。

该项研究的目的是用最大的纤维素复合体对马克斯克鲁维酵母进行工程改造，该复合体可以在细胞表面容纳多达63种酶。为此，研究人员合成了CipA基因（具有9个I型粘附素重复序列）和最大的OlpB基因（具有7个II型粘附素重复序列）。CipA和OlpB基因中的多个重复序列使其克隆甚至DNA合成都极为困难。研究人员通过将重复序列中的密码子随机化并使用高级DNA合成技术合成了CipA和OlpB基因，以此克服这个问题。随后研究人员将这两个基因整合到马克斯克鲁维酵母基因组中。此外，为了了解CipA的粘着蛋白数量和CBM在微囊菌降解中的重要性，研究人员还构建了具有不同数目的粘着蛋白和CBM的CipA变体。

纤维素向单糖的转化至少需要三种酶：内切葡聚糖酶（EGs），外切葡聚糖酶（CBHs）和β-葡萄糖苷酶（BGSs）。此外，已经报道了一类新的氧化酶，称为溶解性多糖单加氧酶（LPMO）。LPMO可以有效降解结晶纤维素，并使可溶性糖释放增加2.6倍，因此被称为“纤维素酶促进剂”。LPMO的活性需要电子，因此将一种称为纤维二糖脱氢酶（CDH）的电子供体与LPMO一起使用。因此，研究人员选择了三种类型的真菌纤维素酶，分别是里氏木霉（TrEgIII）的EG，合成的CBH（CBHII），来自Neocallimastix patriciarum的β-葡萄糖苷酶（NpaBGS）以及纤维素酶增强剂来自Aurantiacus（TaLPMO）和来自嗜热毁丝霉（Thermothelomyces thermophila）（MtCDH）的电子供体，然后将其与C. thermocellum的I型dockerin融合以促进纤维素的整合。工程纤维素酵母菌株有效地将微晶纤维素转化为还原糖或乙醇，适用于整合生物加工（CBP）。

在这项研究中，研究人员设计产生了几种纤维素宿主，包括纤维素酶宿主（CH：表达TrEgIII-t，CBHII-t和NpaBGS-t），加强宿主（BH：表达TaLPMO-t和MtCDH-t），酶宿主（EH：表达TrEgIII-t，CBHII-t，NpaBGS-t，TaLPMO-t和MtCDH-t）和AH（表达OlpB-ScGPI）。同样，通过将CipA变异体整合到表达AH的OlpB-ScGPI中，开发了五种不同类型的支架蛋白宿主（SH）。最后，将EH和AH共同培养形成最大的纤维素体，然后分别使用微晶纤维素（avicel）和磷酸溶胀的纤维素（PASC）来验证乙醇的生产（如下图）。