BioLabs Protocol：拟南芥核质分离实验

来源：植物生物学

溶液配制：

Honda buffer：

25 mM Tris-HCl（pH7.4）

10 mM MgCl2

2.5% (wt/vol) Ficoll 400

5% (wt/vol) Dextran T 40

0.4 M蔗糖

1x Protease Inhibitor Cocktail (用前加)

5 mM DTT (用前加)

10 mM β-巯基乙醇 (用前加)

Triton X-100：20% (vol/vol) 

试剂及耗材：

Triton X-100：#T8787, Sigma, St. Louis, USA

蛋白酶抑制剂(cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets): #11836145001, Roche, Mannheim, Germany

二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol, DTT): AMRESCO, Solon, USA

Ficoll 400: #F4375，Sigma，St. Louis，USA

Dextran T40: #17-0270-01, GE Healthcare, Little Chalfont, England

UGPase抗体: #AS05086, Agrisera, Vännäs, Sweden

Histone H3抗体: #AS10710, Agrisera, Vännäs, Sweden

Miracloth滤布: #475855-1R，Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Germany

实验流程：

1.  称取2 g 10日龄的拟南芥幼苗于液氮中研磨。

2.  将样品转移至预冷的离心管中，并加入4 mL Honda buffer，颠倒混匀后置于冰上10 min，使其充分溶解。

3.  用Miracloth滤布对样品进行过滤。

4.  在滤液中加入终浓度为0.5%的Triton X-100。充分混匀后冰上放置15 min。

5.  取出100 μL样品作为总蛋白（Total protein）。

6.  4℃，离心1500 g，5 min。转移上清至新管，作为去除了核的细胞质组分蛋白（Nuclei-depleted fraction）。再重复离心2次，去除沉淀。

7.  沉淀用1 mL添加了0.1% Triton X-100的Honda buffer进行清洗，洗5次，1500 g，离心5 min。

8.  沉淀用Honda buffer重悬，50 g，离心1 min，以去除细胞碎片，细胞壁及淀粉粒等组分。并将上清转移至新的离心管。

9.  1800 g，离心5 min，收集的沉淀即为核组分（Nuclei-enriched fraction）。将沉淀溶于100 μL Honda buffer中。

10. 将总蛋白、胞质组分和核组分进行SDS-PAGE电泳及Western blot检测分离效果。

11. Western blot所用抗体：细胞质组分特异的UGPase抗体（1 : 500稀释）及核组分特异的Histone H3抗体（1 :5000稀释）对同时对各组分进行检测。

结果示例：

引自ref.3

参考文献：

1. Kinkema et al., Nuclear Localization of NPR1 Is Required for Activation of PRGene Expression, The Plant Cell (2020) 12:2339–235

2.Xia et al., Developmental and hormonal regulation of the Arabidopsis CER2 gene that codes for a nuclear-localized protein required for the normal accumulation of cuticular caxes, Plant Physiology (1997) 115:925-937

3. Long et al., BICELLULAR POLLEN 1 is a modulator of DNA replication and pollen development in Arabidopsis, New Phytologist (2019) 222: 588–603