李继刚团队建立用于研究光敏色素与信号分子光可逆互作的LexA酵母双杂交系统学术资讯

来源：植物科学最前沿

近日，中国农业大学生物学院/植物生理学与生物化学国家重点实验室李继刚教授课题组在aBIOTECH期刊在线发表了题为“A LexA-based yeast two-hybrid system for studying light-switchable interactions of phytochromes with their interacting partners” （点击题目查看原文）的研究论文。该研究建立了基于LexA的酵母双杂交体系，可用于检测光敏色素与信号分子之间的光可逆互作。

光敏色素(phytochrome)是植物的红光和远红光(600-750 nm)受体，以二聚体的形式存在，每个单体上共价结合一个线性的四吡咯环生色团(phytochromobilin，PΦB)。光敏色素有红光吸收型(Pr)和远红光吸收型(Pfr)两种构象形式，Pr吸收红光后转变为Pfr，Pfr吸收远红光后转变为Pr。人们通常认为Pfr是光敏色素的活性形式。迄今为止已报道了许多光敏色素的互作蛋白，而这些互作蛋白与光敏色素的哪种形式相互作用，是人们感兴趣的问题。

酵母双杂交是最常用的检测蛋白-蛋白相互作用的方法之一。商业化的酵母双杂交系统均是将DNA结合结构域(DNA-BD)和激活结构域(AD)置于待研究蛋白的N端，而光敏色素的N端必需自由，才能形成Pr或Pfr构象；此外，酵母细胞中不表达光敏色素的生色团。2002年，Peter Quail教授实验室创建了基于GAL4的酵母双杂交系统(原理见图1A)，将GAL4 DNA-BD置于光敏色素的C端，并向培养基中添加提取自螺旋藻的生色团(phycocyanobilin，PCB)，然后给酵母细胞照射远红光或红光，最终实现了光敏色素Pr/Pfr形式与其互作蛋白在酵母细胞中的光可逆互作。

近20年来该系统被广泛应用于光敏色素领域的研究，对揭示光敏色素信号转导的分子机制发挥了重要作用。但是，也有一些光敏色素与其信号分子的互作(如phyA与COP1及phyA与TZP)，在其他互作系统中得到了验证，但是在该GAL4酵母双杂交系统中检测不到。

图1. 用于检测光敏色素与信号分子光可逆互作的酵母双杂交系统的原理(A)和LexA系统载体图(B)

常用的酵母双杂交系统大都基于GAL4或LexA，两个系统各有特色。李继刚课题组对商业化的LexA酵母双杂交系统进行了改造，在pLexA载体的LexA DNA-BD编码序列上游添加多克隆位点，使LexA DNA-BD置于光敏色素的C端(图1B)。向培养基中添加PCB以及给酵母细胞照射远红光或红光后，李继刚课题组使用该系统验证了几组已知的光敏色素与信号分子的光可逆互作，包括phyA与FHY1/FHL以及phyA/phyB与PIFs的互作，结果表明该系统具有很好的重复性和很高的灵敏度。此外，phyA与COP1以及phyA与TZP这两组在GAL4系统中无法检测到的互作，在该LexA系统中得到了很好的呈现：TZP与Pr和Pfr形式的phyA均互作，而COP1更倾向于与Pfr形式的phyA互作(图2)。

先前的研究表明，光敏色素的Pr形式接收红光后转变为有活性的Pfr形式，而Pfr形式的光敏色素通过与SPA蛋白互作，破坏COP1/SPA蛋白复合体的形成，从而抑制COP1的E3泛素连接酶活性，使光形态建成的促进因子(如转录因子HY5)快速积累，最终促进植物的光形态建成。该LexA系统的结果表明，phyA Pfr可能通过与COP1和SPA蛋白均直接互作，最终破坏COP1/SPA蛋白复合体的形成、抑制COP1的活性，这为深入理解光敏色素的信号转导机制提供了新的线索。