张锋/曹云霞合作发现TTC11A突变与精子鞭毛形态多发异常有关

不育症作为一种主要的健康问题困扰着世界范围内约10-15%的育龄夫妇。男性不育经常由弱畸精子症导致，表现为明显的精子运动能力降低和精子鞭毛形态多发异常（Multiple Morphological Abnormalities of the Flagella,MMAF）【1】。已有研究表明鞭毛内运输（Intraflagellar Transport, IFT）通过在精子鞭毛的生成和维持过程中起重要作用，从而影响精子发生和男性生育力。IFT最初在绿藻Chlamydomonas reinhardtii中被发现，依赖于一种由马达驱动的运输系统，该系统将鞭毛前体物质运输到鞭毛装配点。迄今，在模式生物中已经发现IFT的缺陷会导致一系列纤毛相关疾病以及雄性不育。例如，衣藻中IFT52基因的缺失突变导致鞭毛无法形成；Ift140基因的生殖细胞特异性敲除小鼠由于精子鞭毛畸形和精子数目的显著降低而完全雄性不育；敲除了Ift20，IFT25或IFT27基因的小鼠也全部都表现为雄性不育【2-4】。尽管这么多研究在衣藻和动物模型中都揭示了IFT与鞭毛生成的重要联系，但是IFT在人类男性不育症中的影响和作用还未明确。

对MMAF患者早先的遗传学分析揭示了DNAH1等多个导致鞭毛异常的致病基因，包括本研究团队已经发现的CFAP43、CFAP44、CFAP69、FSIP2和WDR66等基因。然而，这些已知的MMAF基因只能解释大约60%的MMAF患者。这表明MMAF具有很强的遗传异质性，且仍存在着未知的MMAF致病基因。

2019年3月29日，复旦大学张锋教授与安徽医科大学曹云霞教授合作在The American Journal of Human Genetics杂志上发表文章Bi-allelic Mutations in TTC21A Induce Asthenoteratospermia in Humans and Mice，发现了精子鞭毛形态多发异常中TTC21A双等位基因突变。

本研究招募了65例无血缘关系的汉族男性MMAF患者，其中九例来自近亲家庭。这些患者来自安徽医科大学第一附属医院和南京医科大学附属苏州市立医院。65例患者均表现为原发性不育，无明显原发性纤毛运动障碍（Primary Ciliary Dyskinesia, PCD）相关的症状，如支气管炎、鼻窦炎、中耳炎或肺炎；细胞核型分析显示染色体核型正常（46；XY）且Y染色体上无大规模片段缺失。

为了研究人类MMAF相关的未知遗传因素，对65例患者进行了全外显子组测序和相应的生物信息学分析。有趣的是，在一例近亲家系和两例散发患者中鉴定到了TTC21A的双等位突变，并且这三例患者都不能被其他已报道的MMAF基因的致病突变所解释。

TTC21A（tetratricopeptiderepeat domain 21A）也被称作IFT139A，编码的蛋白含有数个TPR（tetratricopeptiderepeat）重复结构域。TPR结构域被报道常存在于IFT蛋白中，对纤毛功能有重要影响。一些TPR家族的蛋白已经被报道与模式生物中纤毛功能有关。例如，TTC10蛋白参与纤毛生成，Ttc10基因的突变鼠表现为多囊肾。值得注意的是，公共表达谱数据库（ENCODE、FANTOM和GTEx）显示，有些TPR家族蛋白，包括TTC21A在内，都在睾丸中特异性高表达。但这些TPR蛋白之前都没有被直接地关联到人类男性不育。研究者在MMAF男性患者鉴定到TTC21A的双等位基因突变，明确了TPR蛋白和男性不育之间的联系。

如下图1所示，在近亲家系患者A004 IV-1中鉴定到了纯合的TTC21A剪接位点突变，c.716+1G>A，该突变影响了6号内含子中的剪接供体位点。精子RT-PCR实验和cDNA测序发现了这个突变会导致6号内含子的部分保留，从而导致出现提前终止密码子（p.Ile240*）。在A015 II-1患者中鉴定到了一个无义突变c.2329C>T（p.Gln777*）和一个错义突变c.341A>G（p.Tyr114Cys）。该错义突变位于保守的、纤毛相关的TPR结构域内，且经三种突变严重性预测软件SIFT、PolyPhen-2和MutationTaster评估都显示有害。A015 II-1患者的这两个突变经家系验证确认分别遗传自父母，为复合杂合突变。在S022 II-1患者中鉴定到了纯合的无义突变c.2563del（p.Val855*）。此外，通过与法国同行合作，研究者在其他人群样本中，还发现了两例突尼斯男性MMAF患者含有TTC21A剪接区域的纯合突变（c.3116+5G>T）。精子RT-PCR检测到该突变会导致mRNA的衰减从而验证了该突变的有害性。

图1. Family A004中TTC21A剪接位点突变

如上所述，研究者在汉族人群中鉴定到了6个TTC21A的等位基因突变，其中的大部分（5/6）都是无义突变。因此还比较了本研究和ExAC数据库中TTC21A的功能缺失突变（附表7，P = 7.01×10-7，双尾Fisher精确检验）。观察结果表明TTC21A功能缺失突变与男性不育密切相关。因此，这些患者的MMAF表型可以优先用鉴定到的这些TTC21A双等位基因突变来解释。

虽然TTC21A的分子功能目前还不清楚，但是STRING（功能蛋白相关网络）中的数据提示人和鼠TTC21A蛋白的大多数预测有功能相互作用的都是IFT组分蛋白。研究者也通过精子免疫共沉淀实验验证到了TTC21A与IFT140、IFT20及IFT52互作。这表明TTC21A很有可能是一个与IFT蛋白相互作用的IFT组分。

TTC21A与其同源蛋白TTC21B有50%的序列相似性，且两者有相似的TPR结构域。TTC21B的突变被报道会导致许多纤毛相关疾病，但并没有导致男性不育的描述。根据Human Protein Atlas数据库，TTC21B在许多组织中广泛表达，包括男性组织和女性组织，而TTC21A在睾丸中特异高表达，且TTC21A的免疫组化信号出现在精母细胞和精子中。TTC21A与TTC21B在表达谱上的差异说明了TTC21A在精子生成中可能有特殊作用。

TTC21A缺陷患者的精子可以观察到头尾连接处的异常和尾巴的多种形态畸形（图2A-E），经透射电镜观察到了多种超微结构的异常如胞浆残余、轴丝结构紊乱、中央微管或外围双联微管的缺失或纤维鞘异常增生（图2F-M）。

图2. 精子形态与超微结构 

本研究还利用CRISPR技术建立了基因编辑小鼠模型，Ttc21a纯合突变的雄鼠表现出了生育力下降甚至不育、精子活力下降和精子形态的畸形。经透射电镜对小鼠睾丸中精子生成过程作细致分析发现，突变小鼠的精细胞在核凝缩和鞭毛后期延长阶段出现了头尾连接处超微结构的异常，如分节柱和环散落、鞭毛中段无法正常形成，从而导致精子核和轴丝的错位。这与光镜下观察到的精子头尾分离的表型一致。此外，突变小鼠的精子鞭毛横截面电镜也观察到了一定比例的超微结构异常如异常空泡、多余外围双联微管、中央微管缺失、动力蛋白臂缺失和“9+2”结构排布紊乱。

总的来说，该研究基于患者和小鼠模型发现了TTC21A的双等位基因可以导致弱畸精子症（精子运动能力下降和精子畸形），且主要作用于精子鞭毛和头尾连接处。另外，也提示了其他TPR基因或IFT基因参与人类弱畸精子症或其他纤毛疾病的可能。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2019.02.020.

制版人：子阳

参考文献

1. Coutton, C., Escoffier, J., Martinez, G., Arnoult, C., and Ray, P.F.(2015). Teratozoospermia: Spotlight on the main genetic actors in the human.Hum. Reprod. Update 21, 455–485.

2. Zhang, Z., Li, W., Zhang, Y., Zhang, L., Teves, M.E., Liu, H., Strauss,J.F., 3rd, Pazour, G.J., Foster, J.A., Hess, R.A., and Zhang, Z. (2016).Intraflagellar transport protein IFT20 is essential for male fertility andspermiogenesis in mice. Mol. Biol. Cell 27, 3705–3716.

3. Liu, H., Li, W., Zhang, Y., Zhang, Z., Shang, X., Zhang, L., Zhang,S., Li, Y., Somoza, A.V., Delpi, B., et al. (2017). IFT25, an intraflagellartransporter protein dispensable for ciliogenesis in somatic cells, is essentialfor sperm flagella formation. Biol. Reprod. 96, 993–1006.

4. Zhang, Y., Liu, H., Li, W., Zhang, Z., Shang, X., Zhang, D., Li, Y.,Zhang, S., Liu, J., Hess, R.A., et al. (2017). Intraflagellar transporterprotein (IFT27), an IFT25 binding partner, is essential for male fertility andspermiogenesis in mice. Dev. Biol. 432, 125–139.