Nature ： Caspase-8通过切割RIPK1缓解凋亡和坏死过度激活

来源：BioArt

细胞凋亡 (apoptosis) 和细胞坏死 (necroptosis) 是控制细胞死亡的两条互补的信号通路，并且都受上游信号，受体蛋白，支架蛋白，蛋白激酶以及蛋白酶所调控。而蛋白酶Caspase-8在死亡受体 (death receptors) 介导的细胞坏死过程中就扮演着十分重要的角色。

Caspase-8属于半胱氨酸蛋白酶 (caspase) 家族，它们的一个重要共同点是活性位点 都含有半胱氨酸 ，并特异地断开天冬氨酸残基后的肽键，细胞中合成的caspase 以无活性的酶原 状态存在，其活化过程需在两个亚基 的连接区的天冬氨酸位点进行切割，产生由两个亚基组成的异二聚体。现已确定的caspase家族的蛋白酶至少有11种，并且他们中的大多数都可以直接参与凋亡信号的转导。Caspase-8参与细胞凋亡的起始，它除了对自身进行切割活化之外，其底物还包括c-Flip【1】,CYLD【2】,RIPK1【3】以及RIPK3【4】。以往研究表明：caspase-8对于小鼠胚胎发育至关重要，因为人们发现caspase8敲除的小鼠会由于过度激活的细胞坏死而引起胚胎致死【5】。但没有搞清楚的是caspase-8在体内究竟切割的是什么底物从而抑制了MLKL和RIPK3介导的细胞坏死过程并维持胚胎的正常发育？

2019年9月12日，来自美国基因泰克公司的Vishva M. Dixit教授在Nature上发表了题为Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis 的研究，报道了caspase-8可以通过切割RIPK1蛋白从而限制凋亡和坏死信号的过度激活，维持胚胎的正常发育。

为了验证caspase-8对于小鼠胚胎发育至关重要，作者构建了caspase8酶活缺失的Casp8C362A/C362A knock-in的小鼠模型。与Casp8−/−小鼠类似，Casp8C362A/C362A小鼠卵黄囊血管 (yolk sac vasculature) 发育异常，并且在E10.5-E12.5    期间死亡，而MLKL缺失的Casp8C362A/C362A mlkl−/−小鼠则可以正常存活。这说明caspase-8可以在胚胎发育的过程中限制由MLKL介导的细胞坏死信号的过度激活。

那么caspase-8作用的底物蛋白是什么呢？caspase-8除了可以切割自身以外，其底物蛋白还包括c-Flip,CYLD,RIPK1以及RIPK3（注：Caspase-8还可通过切割GSDMD为活性形式引发焦亡。2018年两篇研究赋予了凋亡Caspase-8参与焦亡过程的新功能，详见此前BoArt的相关报道：重点推荐！Science+PNAS更新认识，赋予Caspase-8参与细胞焦亡过程的新功能——邵峰点评）。如果caspase是通过切割这些底物蛋白来抑制细胞坏死信号的过度激活，那么将这些蛋白的ASP切割位点突变掉应该可以模拟caspase-8的酶活缺失并且会导致胚胎致死。作者发现，只有Ripk1D325A/D325A小鼠由于突变掉caspase-8切割位点之后无法存活。但出乎意料的是，Ripk1D325A/D325A Ripk3−/− 和 Ripk1D325A/D325AAMlkl−/−也无法存活，这提示Ripk1D325A/D325A小鼠的胚胎致死现象并不是由于过度激活的细胞坏死导致的。因此作者用免疫荧光的方法在Ripk1D325A/D325A小鼠胚胎内检测了细胞凋亡的标志物—Cleaved caspase-3，发现其表达显著上升，说明RIPK1 (D325A) 导致卵黄囊血管细胞凋亡。另外，Ripk1D325A/D325A Mlkl−/− Fadd−/−小鼠可以存活，这进一步说明RIPK1(D325A)小鼠胚胎致死现象有部分原因是由于FADD介导的细胞凋亡所致。

最后，作者对RIPK1 (D325A) 的致死性进行了进一步地探究。他们发现Ripk1D325A/+杂合体小鼠能很好地存活，但是该小鼠来源的细胞对于TNF-α刺激更加敏感。另外小鼠生存实验证明：TNF-α诱导的细胞凋亡与细胞坏死相比是造成Ripk1D325A/+小鼠死亡的主要诱因。因为Ripk1D325A/+Mlkl−/−与Ripk1D325A/+小鼠相比在接受TNF-α刺激后生存时间都很短，而Ripk1D325A/+ Mlkl−/− Fadd−/−则可以一直存活。

综上，作者的研究表明，RIPK1的Asp325位点是保护机体在发育过程中抵御因细胞凋亡和细胞坏死信号过度激活引起胚胎致死的一个关键位点，同时由于ASP325位点是已经报道caspase-8切割RIPK1的位点【3】，因此作者推测caspase-8是通过切割RIPK1来限制细胞凋亡和细胞坏死信号的传导，维持胚胎的正常发育。

当然，作者也承认现有的数据并不能排除RIPK1 (D325A) 由于蛋白构象的改变从而促进了其与FADD或者caspase-8蛋白相互作用，并最终导致细胞死亡的可能性。但无论如何，RIPK1的Asp325位点对于限制凋亡和坏死信号过度激活至关重要，这对于今后的研究具有很重要的指导意义。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1548-x

参考文献

1. Pop, C. et al. FLIPL induces caspase 8 activity in the absence of interdomain caspase 8 cleavage and alters substrate specificity. Biochem. J. 433, 447–457(2011).

2. O’Donnell, M. A. et al. Caspase 8 inhibits programmed necrosis by processing CYLD. Nat.Cell Biol.13, 1437–1442 (2011).

3. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y. & Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514–2526 (1999).

4. Feng, S. et al. Cleavage of RIP3 inactivates its caspase-independent apoptosis pathway by removal of kinase domain. Cell. Signal. 19, 2056–2067 (2007).

5. Kaiser, W. J. et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature 471, 368–372 (2011).