Nat Chem Biol： 肠道菌群抑制沙门氏菌毒性的新机制

来源：BioArt

近年来，肠道菌群研究极大拓展了人们对肠道菌群以及其对人类健康的影响的理解。肠道菌群在预防和治疗肠道病菌感染方面表现突出，尤其是在临床治疗艰难梭菌的反复感染中，肠道粪菌移植取得了很好的效果。然而，我们对肠道菌群抵御外来病菌的侵染以及治疗感染的分子机制仍然不够了解。揭示肠道有益细菌（commensals）拮抗病菌的分子机制有助于指导临床肠道菌群移植，并有可能转化为新型抗生素用于细菌感染治疗。

短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFA）是一类肠道内非常丰富的小分子，包括乙酸、丙酸、丁酸等，主要由肠道内的厚壁菌门细菌对食物中人类无法消化的植物纤维发酵而成。肠道内短链脂肪酸浓度被认为是肠道健康的重要指征，而且它们在肠道免疫系统的发育与调控中发挥着重要作用，因此也对宿主免疫系统对感染的抵御产生影响。然而，短链脂肪酸也可以直接对入侵病菌产生作用，如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），其三型分泌系统（Type III Secretion System）介导的侵染毒性可被丁酸削弱。然而，丁酸抑制三型分泌系统的具体分子机制尚未清楚。

2019年11月18日，洛克菲勒大学Howard Hang实验室的张桢润博士等在Nature Chemical Biology上发表题为Site-specific acylation of a bacterial virulence regulator attenuates infection的文章。作者创新性地使用生物正交的短链脂肪酸探针对沙门氏菌内短链脂肪酸的蛋白靶点实现了探测，在确认靶点后，又联合使用CRISPR-Cas基因编辑和非天然氨基酸插入系统等化学生物学工具，实现了沙门氏菌内源蛋白的定点翻译后修饰模拟，从而揭示了短链脂肪酸通过蛋白翻译后修饰抑制三型分泌系统这一新机制。

为了无差异地鉴定短链脂肪酸在鼠伤寒沙门氏菌内的蛋白靶点，作者们首先使用实验室开发的短链脂肪酸探针戊炔酸（Alk-3）对细菌进行标记，并用点击化学（Click Chemistry）富集蛋白靶点，以及进行定量蛋白组学检测。作者们发现有56个蛋白被特异性富集了，其中包括6个三型分泌系统蛋白。其中一个蛋白HilA尤其有趣，因为它是沙门菌致病岛1（Salmonella Pathogenicity Island 1, SPI-1）的主调节因子。随后通过质谱等方法的验证，作者们发现HilA可以被短链脂肪酸在一系列赖氨酸残基上翻译后修饰，包括乙酰化、丙酰化、丁酰化修饰。

这些翻译后修饰是如何影响HilA蛋白功能的呢？传统的点突变方法只能将修饰抹去，并不能回答蛋白加上修饰后功能有什么变化。作者们使用了非天然氨基酸插入系统，在可被修饰的赖氨酸残基的位置定点插入丁酰化赖氨酸类似物（lysine butyrylation-mimic, bmK），其模拟赖氨酸丁酰化的同时并不会被细菌内源的去酰化酶移除，从而实现了对蛋白的稳定且定点的修饰。作者们进而在沙门氏菌内首次实现CRISPR-Cas基因编辑并优化了编辑流程，从而完成了内源HilA蛋白的定点bmK插入。表征实验发现，bmK插入的位点会显著影响HilA调控的下游基因的表达和细菌毒性，揭示了短链脂肪酸对HilA的修饰并不全都影响功能，位点是调控蛋白功能的关键。值得注意的是，K90在HilA的DNA结合域内，作者们猜测此处的修饰减弱了蛋白的DNA结合能力。交联-免疫共沉淀测序（crosslinking-IP-seq）确实证明如此。

由于K90丁酰化修饰丰度最高且分子机制明确，作者们在小鼠感染模型中测试了K90bmK突变体的毒力。这个突变确实削弱了沙门氏菌在小鼠内侵染、扩散和引起肠道炎症的能力。既然如此，如果这些赖氨酸位点被突变为不能被修饰且保证蛋白活性的突变体，那么沙门氏菌的毒力是不是不再受到短链脂肪酸的影响呢？于是作者们将三个赖氨酸位点同时突变为精氨酸（K90,324,456R），并在健康且未服用抗生素的老鼠中进行口服感染，这些小鼠的肠道内有正常浓度的短链脂肪酸。果然，相较于野生型菌株，K90,324,456R突变体能在这些小鼠内拥有更强的毒力，而在口服抗生素后短链脂肪酸缺乏的小鼠肠道内，这个突变体则和野生型菌株有相似毒力。因此，作者们同时证明了HilA的K90, K324, K456等位点的丁酰化修饰对沙门氏菌毒性减弱的充分性与必要性，揭示了新的一种短链脂肪酸抑制肠道病菌毒性的分子机制。这项研究还为新型抗生素的研究提供了思路，即酰化试剂有可能成为一种选择性高、非细菌致死性的细菌毒性抑制剂。

本文第一作者张桢润博士本科毕业于北京大学化学与分子工程学院，在陈鹏教授实验室完成本科生科研，随后在洛克菲勒大学获得博士学位，导师为Howard Hang，目前在芝加哥大学杜克索斯家族研究所Eric Pamer实验室继续从事肠道菌群方面的博士后研究。本文共同作者还有北京大学深圳研究生院化学生物学与生物技术学院副教授彭涛等。这项工作还得到了北京大学陈鹏实验室、洛克菲勒大学Luciano Marraffini实验室等的鼎力帮助。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41589-019-0392-5