童亮课题组等揭示histone pre-mRNA 3'端加工的分子机制

来源：BioArt

原标题：Science：童亮课题组等揭示histone pre-mRNA  3'端加工的分子机制

在多细胞生物中，几乎所有的mRNA前体(pre-mRNA)的3’端加工都是通过核酸内切酶在特异性位点的切割和在该位点添加poly(A) 尾两个步骤完成的。但是复制依赖型组蛋白(replication-dependent histone) pre-mRNA是个特殊的类别，这些蛋白是核小体(nucleosome)的重要组成部分，仅在细胞周期的S期快速大量表达以包裹新复制合成的DNA，与经典的以poly(A) 结尾的mRNA不同，组蛋白 mRNA是以一段保守的茎-环结构(stem-loop)作为其成熟mRNA的3’末端【1】。两者采用不同的3’端加工机器，然而，进化中负责切割两种pre-mRNA的蛋白质模块却是相同的。该模块由核酸内切酶CPSF73，其同源蛋白CPSF100，脚手架蛋白Symplekin和切割促进因子CstF64组成，该模块在组蛋白通路中被称作HCC (histone pre-mRNA cleavage complex)，在经典poly(A) 通路中被称作mCF (mammalian cleavage factor)。核酸内切酶的活性在体内需要受到精确的调控，因此HCC/mCF模块在两条通路中均需要多个辅助蛋白的参与来帮助其识别正确的pre-mRNA底物以及诱发核酸内切酶CPSF73的激活。但至今对于HCC/mCF 如何催化切割pre-mRNA以及与辅助蛋白之间如何互作的分子机制依然知之甚少。

美国哥伦比亚大学童亮研究组曾在2006年解析了核酸内切酶CPSF73 闭合状态的晶体结构【2】，并且多年来一直从事对 pre-mRNA 不同类型3’端加工机器的结构生物学研究。近年，童亮研究组与洛克菲勒大学Thomas Walz研究组合作利用冷冻电镜技术(Cryo-EM) 阐明了人类pre-mRNA 3’端加工经典通路中poly(A) 信号AAUAAA的识别机制【3】和重要蛋白模块的组装机制【4】（详见BioArt报道：Mol Cell | 童亮课题组等揭示pre-mRNA的3’端加工机制）。研究发现mCF/HCC自身结构高度动态，推测mCF 必须进行一系列的结构重排，才能实现对RNA的切割。 

为了揭开mCF/HCC激活机制的谜题, 2020年2月7日，童亮研究组， Thomas Walz研究组和北卡罗来纳大学教堂山分校的William Marzluff研究组合作在Science发表论文，题为：Structure of an active human histone pre-mRNA 3'-end processing machinery。研究人员利用13个重组蛋白和两条RNA重构出具有切割活性的人类组蛋白pre-mRNA 3’端加工机器，并且解析了催化状态下复合物的冷冻电镜结构（图1）。结构揭示出不同蛋白之间精细地协同互作，从而实现核酸内切酶CPSF73精确切割RNA的分子机制，很好的解释了大量生化和功能实验中的数据，并且对于经典通路pre-mRNA和snRNA 3’端加工有重要的提示作用。

图1人类组蛋白pre-mRNA 3’端加工机器的结构 

人类组蛋白pre-mRNA 3’端加工机器由HCC，U7 snRNP (small nuclear ribonucleoproteins), FLASH和茎环结构结合蛋白SLBP (stem-loop binding protein)组成，组蛋白pre-mRNA作为其底物（图1）。3’端加工位点位于保守的茎环结构SL(stem-loop)和组蛋白pre-mRNA下游序列元件HDE (histone down stream element)之间。SLBP蛋白可以特异性识别该茎环结构【5】。 

在样品的制作过程中，研究人员通过低温来减慢3’端加工的进程，并且收集大量冷冻电镜数据，仔细分类，从中成功捕捉到pre-mRNA位于核酸内切酶CPSF73活性位点，准备被切割的状态，即核心部分(core) 3.2 Å的冷冻电镜结构（图1）。结构解释了3’端加工位点具有腺嘌呤特异性的原因，并阐明CPSF73切割RNA的分子机制。 

结构显示，HDE与U7 snRNA形成RNA双螺旋，HCC中Symplekin N端结构域、CPSF100的β-CASP结构域和CPSF73的metallo-β-lactamase结构域从三个侧面对该双螺旋识别，使原本处于高度动态的HCC发生结构重排（图2）。研究人员指出该识别是HCC和CPSF73激活的关键性起始步骤， 

值得注意的是，与闭合状态的CPSF73相比，其β-CASP结构域相对于 metallo-β-lactamase结构域发生了17o的旋转，从而产生可以容纳单链RNA的“狭缝”，实现切割。结构对比发现 U7 snRNP中的Lsm10，其保守的N和C端与关闭状态的CPSF73 β-CASP结构域存在空间位阻，且Lsm10的C端部分位于“狭缝”的边缘，与底物有相互作用（图2）。研究人员推测Lsm10是诱发CPSF73激活的关键蛋白。HCC识别HDE-U7双螺旋发生结构重排后，迫使CPSF73与Lsm10靠近，Lsm10引起CPSF73结构域的重排。

图2 HCC和CPSF73 的活性状态 

在核心部分 3.2 Å的结构中，研究人员发现并没有属于FLASH和SLBP蛋白的密度图，但功能实验表明这两个蛋白的缺失会影响组蛋白pre-mRNA 3’端加工机器的激活，所以研究人员对该核心部分结构进一步分类，解得复合物整体4.1Å的冷冻电镜结构（图1）。结构结合生化实验显示FLASH形成长80Å的coiled coil结构【6】，连接HCC中symplekin C端结构域、SLBP-茎环结构和U7 snRNP中的Lsm11，帮助协调拉近各个组份，进而帮助底物成功进入CPSF73激活产生的“狭缝”中。 

人类组蛋白pre-mRNA 3’端加工机器催化状态的结构揭示了其组装和激活机制。结合生化数据，研究人员提出了组蛋白pre-mRNA 加工循环（图3）：U7 snRNP(步骤I)结合FLASH(II)，随后招募HCC(III)，在结合底物pre-mRNA之前，整个加工机器高度动态，伴随着对pre-mRNA的识别，HCC和CPSF73激活(IV，即本文结构)，切割后(V)，5’端产物释放，3’端产物被核酸外切酶降解，蛋白复合物进入下一个切割循环。 

图3组蛋白pre-mRNA 加工循环

美国哥伦比亚大学童亮研究组的孙亚东博士和洛克菲勒大学Thomas Walz研究组的张一小博士为该论文的共同第一作者。

原文链接：

https://science.sciencemag.org/content/367/6478/700

参考文献

1, Dominski Z., Marzluff WF. (2007) Formation of the 3' end of histonemRNA: getting closer to the end. Gene 396, 373-390.

2, Mandel, C.R., Kaneko, S., Zhang, H., Gebauer, D., Vethantham,V., Manley, J.L., and Tong, L. (2006). Polyadenylation factor CPSF-73 is thepre-mRNA 3'-end-processing endonuclease. Nature 444, 953-956.

3, Sun, Y., Zhang, Y.,Hamilton, K., Manley, JL, Shi, Y., Walz, T., and Tong, L. (2018). Molecularbasis for the recognition of the human AAUAAA polyadenylation signal. Proc NatlAcad Sci USA 115, E1419-E1428. (Epub Dec. 5, (2017))

4, Zhang Y, Sun Y, Shi Y,Walz T, Tong L. (2019) Structuralinsights into the human pre-mRNA 3'-end processing machinery. Molecular Cell. 2019 Nov 25 (Epub ahead of print)

5, Tan D., Marzluff WF.,Dominski Z., Tong L., Structure of histone mRNA stem-loop, humanstem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science 339, 318-321(2013).

6, Aik WS et al., TheN-terminal domains of FLASH and Lsm11 form a 2:1 heterotrimer for histonepre-mRNA 3'-end processing. PLoS One 12, e0186034 (2017).